人β-分泌酶与阿尔茨海默病

邓青山 马全红 徐如祥

人β-分泌酶与阿尔茨海默病

邓青山1马全红2徐如祥3

阿尔茨海默病(AD)是最常见的引起痴呆的神经退行性疾病，主要表现为进行性的认知功能障碍和行为能力障碍，其病理特征是神经细胞外不溶性淀粉样蛋白Aβ以及胞内由过磷酸化tau形成的纤维缠结.这种胞外聚合物主要由Aβ4两组成，它是由淀粉样前体蛋白APP依次经β分泌酶(β-secretase)和γ分泌酶(γ-secretase)剪切所产生的。沉积和细胞内过量的Tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结（NFTs），从而引起氧化应激和慢性炎症损伤，导致神经元丢失和突触功能障碍。基于对AD病理特征认识，以往将针对Aβ和NFTs的治疗作为AD治疗的主要方向，但是经过数十年的研究并未取得长足的进展。近年来，随着人们对β淀粉蛋白前体蛋白（APP）处理途径的认识不断深入，人们越来越重视APP降解产生Aβ的关键酶在AD发病中的作用。因此，本文就人β-分泌酶（β-secreatase,BACE1）的相关特性及在AD发病中的相关作用，以及在AD治疗中的研究进展做一综述。

人β-分泌酶；阿尔茨海默病；β淀粉蛋白前体蛋白

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的引起痴呆的神经退行性疾病，主要表现为进行性的认知功能障碍和行为能力障碍，严重影响患者日常生活水平[1]，本病从明确诊断到患者死亡通常只有3～9年的时间[2]。目前全球有超过3 500万AD患者，而且这一数字还在不断增加，给社会和家庭带来沉重的经济负担[2]。AD的主要病理特征为细胞外β淀粉蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积和细胞内过量的Tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结（neurofibullar tangels，NFTs），从而引起氧化应激和慢性炎症损伤，导致神经元丢失和突触功能障碍[3]。基于对AD病理特征认识，以往将针对Aβ和NFTs的治疗作为AD治疗的主要方向，但是经过数十年的研究并未取得长足的进展。近年来，随着人们对β淀粉蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）处理途径的认识不断深入，人们越来越重视APP降解产生Aβ的关键酶在AD发病中的作用。因此，本文就BACE1的相关特性及在AD发病中的相关作用，以及在AD治疗中的研究进展做一综述。

一、β淀粉蛋白假说

APP对神经元的维持，突触可塑性以及记忆形成和维持等多种脑功能都具有重要作用[4]。而且APP的许多生理功能也是通过其蛋白酶解产生来实现的。APP有非淀粉蛋白途径和淀粉蛋白途径两种蛋白裂解方式，通过α、β、γ三种酶完成。生理状况下两种途径均存在，且以非淀粉蛋白途径为主[5]。APP在α分泌酶的作用下生成分泌型α-APP和α-CTF，分泌型α-APP具有神经保护、营养作用并能调节细胞兴奋性和突触可塑性[6]。在α分泌酶无法剪切APP的情况下，APP陷入内吞小泡在β分泌酶和γ分泌酶的作用下产生Aβ。Aβ对调节突触可塑性也有重要作用。Aβ能通过乙酰胆碱能受体途径增强海马LTP，但Aβ也能通过GABA抑制神经的过度兴奋和抑制突触生长。突触活动能增加β内分泌酶活性，生成Aβ肽，后者通过AMPA和NMDA受体抑制兴奋性传递，也提示Aβ在神经可塑性方面的作用。

APP与β分泌酶和早老素(presenilin，PS1)可共存于一个囊泡，经轴突顺向快速运输到突触前部位。虽然不清楚这个囊泡是否含有神经递质及是否通过网格蛋白介导的方式生成，但突触活性增强可以引起Aβ分泌增多，Aβ通过NMDA受体诱发Ca2+内流，从而激活calpain，导致dynamin 1降解。Dynamin在许多囊泡运输通路中发挥重要作用，其降解增多直接影响突触传递。病理状况下，如21三体综合征，AD相关基因突变等均可导致淀粉蛋白途径活性增强，产生超过生理水平的Aβ。γ分泌酶可在不同位点进行本酶切，APP经淀粉蛋白途径主要产生38、40、42个氨基酸三种大小的Aβ[7]。而Aβ42比其它形式的Aβ具有更高的自聚性，发生自身交联形成寡聚体结构，Aβ寡聚体通过NMDA依赖的信号通路降低海马树突棘密度，破坏海马突触可塑性引起突触功能障碍。而且Aβ42有更强的神经毒性，是老年斑形成、氧化应激、慢性炎症反应及神经元丢失导致AD发病的主要因素[8]。

二、BACE1结构及生理特征

人β-分泌酶（β-secreatase，BACE1）基因位于11号染色体，包括9个外显子和8个内含子，全长30.6 kb。BACE1蛋白由501个氨基酸组成，表达于大多数细胞和组织中，尤以神经细胞和神经组织中表达最高[9,10]。BACE1是目前已知的仅有的两个跨膜天冬氨酸蛋白酶中的一个，这也表明了其特殊重要性。BACE1有一个典型的具有活性天冬氨酸指的双叶状结构，其突变会导致BACE1酶活性丧失。除了全长BACE1外，还有476，457，432个氨基酸长度的亚型，但是在淀粉蛋白途径中起关键酶作用的却是全长型BACE1[11,12]。BACE1首先在内质网中合成为蛋白前体，再转动到高尔基体中经糖基化等一系列翻译后修饰成成熟的BACE1蛋白进而发挥生理功能。BACE1在前体蛋白形式时分子量大约60 kDa，而当一系列翻译后修饰完成后达75 kDa。

BACE1做为APP淀粉蛋白途径的关键酶，其主要生理功能即是调控APP蛋白的降解产生Aβ。BACE1的酶活性对其生理功能的发挥非常重要。BACE1酶活性主要受环境pH的影响，其最适pH大约为4.5[13]。因此，BACE1在拥有酸性环境的细胞器中活性更强。

三、BACE1与BACE2的相关性

BACE2与BACE1具有75%同源性[14]。两者都有天冬氨酸酶活性结构，C末端跨膜区域这些重要的特征性结构。BACE1位于11q23.3，在大脑神经元中有稳定的高表达，而BACE2位于21q22.3，在脑中则几乎检测不到，且主要表达在胶质细胞中。这表明两者发挥着不同的生理功能。研究也表明BACE2主要在Aβ区域内裂解APP，阻止Aβ生成，发挥着与BACE1相反的作用[15]。因此，BACE2虽然与BACE1有相当大的同源性，但并不是β分泌酶的亚型，而是一种新的θ分泌酶[16]。

四、BACE1在AD中的蛋白水平与酶活性的改变

随着人们BACE1研究的不断深入，形成了一个新的假说，即BACE1蛋白表达改变可引起AD发病。研究人员发现在AD模型鼠中BACE1的蛋白表达水平显著高于同龄野生鼠[17,18]；在AD患者的脑样本中也检测到BACE1的蛋白水平和酶活性都比非AD患者脑中BACE1蛋白水平和酶活性有显著升高[19-21]。而且，BACE1蛋白表达形式与表达水平与其酶活性程度一致[22-24]。但是研究表明在AD患者中BACE1的RNA水平改变并不显著，BACE1蛋白水平的增高和酶活性增强可能是基于病理状况下，BACE1转录后或者蛋白稳定性的改变引起的[25,26]。因此，研究人员重点关注对BACE1蛋白水平和酶活性的调控，进行了大量的细胞和动物模型的研究和实验，以及进行药物临床实验，以期实现对AD病理和行为改变的治疗，解决这一威胁人类健康的重大疾病。

五、BACE1作为阿尔茨海默病治疗靶点的研究进展

阿尔茨海默病研究的一个重要转折点无疑是BACE1基因的发现和其作用的认识。BACE1通过蛋白裂解APP起始Aβ生成。BACE1基因表达在APP处理过程中具有至关重要的作用。因此，许多研究人员都将对AD的治疗重点转向对BACE1的抑制。已有大量研究表明BACE1基因删除或表达抑制后，Aβ生成显著减少甚至消失，能有效抑制或改善AD样表现和病理。另一方面，研究人员们评估了BACE1表达水平与酶活性改变后对正常生理表现和行为学的影响。而动物实验表明BACE1敲除后并不会引起异常行为表现或显著的病理改变。因此，BACE1作为APP淀粉蛋白途径的关键限速酶，寻找BACE1相关的抑制因子对AD治疗具有里程碑意义。

1.BACE1的转录调控：BACE1转录表达具有明显的组织特异性。Vassar等[22]研究发现BACE1在脑中有显著性高表达，而在其它组织中表达较低。BACE1与APP在脑和脊髓中均高表达，而在其它组织中低表达的情况一致（来自BioGPS.org，2015-01-30）。这不仅提示了BACE1在APP蛋白裂解中的特殊重要性，也提示我们可以将对BACE1的调控作为减少Aβ产生，改善AD病理的一个重要方面。对BACE1水平的控制可以在转录水平和转录后水平来实现。从转录水平的调控主要是抑制BACE1基因表达，从而减少BACE1蛋白产生；而从转录水平的调控则主要是通降低BACE1蛋白稳定性，加速BACE1蛋白降解来实现。BACE1的RNA水平与蛋白水平和酶活性缺乏相关性也为BACE1的转录调控提供了依据[27]。

RNA干扰做为调控基因转录的一个重要方式，在AD疾病研究和治疗中具有重要意义。许多研究表明用带有靶向于BACE1基因的siRNA病毒载体可以敲除或显著降低BACE1的RNA和蛋白水平，APP裂解产生Aβ减少，老年斑减少，海马神经元树突和轴突病理改善[28-29]。基于AD的病理特征，普遍认为任何减少毒性Aβ产生的方式，在不会引起异常病理改变的情况下均可做为AD治疗的潜在手段。由于BACE1基因敲除并未影响胚胎发育，也不会引起出生后明显的形态，生理，生化异常，行为异常和病理改变[30]，因此，BACE1 RNA干扰可做为AD治疗的一个重要干预手段。

然而，BACE1完全敲除是否存在预想不到的副作用还有待进一步的认识。Cole和Vassar[31]研究发现完全敲除BACE1基因后，BACE1基因敲除鼠虽然社会认知没有异常，但是表现出异常的时间空间记忆和参考记忆。而且，BACE1敲除可能引起异常脱髓鞘。有研究发现神经调节蛋白-1（neuregulin-1）是BACE1的底物，对髓鞘形成和维持有重要作用。这些潜在的副作用成为BACE1基因敲除技术用于治疗AD的一个重要难题。因此，RNA干扰技术现在还并不成熟，有待更进一步的研究。

2.BACE1抑制剂：由于BACE1在AD发病过程中具有重要作用，研究人员将BACE1作为治疗AD的一个重要靶点[32]。由于BACE1敲除并不会导致显著病理表现，而且可以改善AD鼠记忆，减少老年斑等病理，许多药企或科研机构也致力于通过不同方法研发不同的BACE1抑制剂[33]。有的已经进入临床试验。CTS-21166是第一个报道体内有效的BACE1抑制剂，并且顺利完成一期临床实验。另一个BACE1抑制剂GRL-8234也具有相似的特性，在动物实验中表现出良好的耐受性和低毒副作用，并且可改善AD模型鼠的阿尔茨海默样病理改变和记忆改善[34]。MK-8931也是一种新型的有效的BACE1抑制剂，目前已经进行二期临床实验，取得了良好效果并有望进入三期临床试验。目前这三种BACE1抑制剂的相关毒副作用研究未见报道，不过要最终应用于临床，仍有待更多实验的证实。

有研究学者研发的BACE1抑制剂LY2811376在临床实验中证实对BACE1有确切抑制作用，而且可以降低脑脊液Aβ水平。但是在动物实验中发现LY2811376会引起视网膜上皮细胞增大和细胞毒性产生，从而导致这一BACE1抑制剂临床试验的终结。另一项动物实验表明BACE1抑制剂SCH1682496和LY2811376虽然可以抑制Aβ产生和AD相关病理表现，但是长时间使用这些抑制剂会导致神经元突触可塑性和认知功能障受损。因此，SCH1682496和LY2811376两种药物并不能真正安全有效地应用于AD的临床治疗。

因为AD是一个进展十分缓慢的疾病，治疗时用药时间长，摄药剂量大，因此开发BACE1抑制剂的困难主要是缺乏BACE1特异性、分子量过大导致的血脑屏障通透障碍、以及其它的引起正常生理功能障碍的问题。对BACE1抑制剂的研发主要需要考虑的是药物安全性和长期使用可能引起的毒副作用的认识和鉴定。这仍将是一个漫长而艰难的过程。

3.ACE1活性的调节：对BACE1的调控除了转录和翻译水平的调控外，还可以对BACE1酶活性进行调节从而减少其对APP的处理。鞘氨酸激酶1/2（sphingosine kinase，SphK1/2）磷酸化鞘氨酸产生一磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）。有研究发现S1P可直接调控小鼠神经元中BACE1活性。当SphK受抑制或S1P过表达时，BACE1活性降低，Aβ产生减少。S1P对BACE1活性的调控是通过与全长BACE1直接结合来实现的。网状酶素家族蛋白（RTN1，RTN2，RTN3和RTN4）与BACE1直接结合，并调控BACE1的活性。网状酶素家族蛋白表达增强时，BACE1活性受抑制，APP蛋白酶切产生Aβ减少，而当网状酶素家族蛋白表达受抑制时，BACE1活性增强，APP蛋白酶切产生Aβ增加。有研究发现抗糖尿病药物二甲双胍处理小鼠原代神经元可以通过干扰一个BACE1信使RNA-蛋白复合体来降低BACE1蛋白水平，并降低BACE1酶活性，从而减少APP经淀粉蛋白途径产生Aβ，改善AD病理。而且研究表明二甲双胍可改善AD模型鼠的空间认知能力。提示二甲双胍可能是一种有效的BACE1酶活性抑制剂，在AD治疗中有潜在价值。因此，对BACE1酶活性调控的研究具有非常重要意义，是AD治疗中靶向于BACE1的一个重要方面。

总的来说，BACE1是起始APP淀粉蛋白途径降解的关键限速酶，在AD发病及病理进展中具有十分重要的作用。目前AD的研究热点也是将BACE1作为治疗靶点，运用不同方法进行转录水平调控及转录后水平的调控，如促进BACE1降解，降低BACE1活性等，从而研发AD治疗的新手段和新药物。而且，随着研究不断深入，肯定会开发运用更多的方法拓展AD治疗的领域。尽管这一方面的研究任重道远，但前景广阔。

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Human beta-secretase and Alzheimer's disease

Deng Qingshan g1,Ma Quanh ong2,Xu Ruxiang3.
1Neurosurgery department of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000 China;2Institute of Neuroscience,Soochow University,Suzhou 215021,China;3Institute of Neuroscience of Beijing Military Region,Beijing 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

Alzheimer's disease(AD)is the most common cause of dementia,neurodegenerative diseases,mainly characterized by progressive cognitive dysfunction and behavioral disabilities,its pathological characteristics are nerve cells outside insoluble amyloid beta and intracellular fiber which is formed by a phosphorylated tau tangles.This kind of extracellular oligomeric is mainly composed of Aβ,which is sequentially cleavaged the amyloid precursor protein APP byβ-secretase and γ-secretase. Deposition and excessive tau protein phosphorylation in cells form a nerve fiber tangles(NFTs),so as to cause oxidative stress and chronic inflammation damage,which leads to neuronal loss and synaptic dysfunction.In the past,based on the understanding of AD pathology characteristics,we focused on Aβ and NFTs as the main direction of AD treatment,but over decades of research we have not made great progress.In recent years,as the in-depth and developmental understanding of beta amyloid protein precursor protein(APP)processing,people pay more and more attention to β-site APP-Cleaving Enzyme 1,a key enzyme in Alzheimer disease(AD).Therefore,the β-secretase(BACE1)related features,functions and the related treatment progress in Alzheimer disease are reviewed in this paper.

BACE1 protein,human;Alzheimer Disease;Amyloid beta-protein precursor

2015-02-28)

(本文编辑：张丽)

DOI∶10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.04.011

637000南充，川北医附院神经外科1；100700北京，北京军区神经外科研究所2；215021苏州，苏州大学神经科学研究所3

徐如祥，Email∶zjxuruxiang@163.com

邓青山,马全红,徐如祥.人β-分泌酶与阿尔茨海默病[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(4)∶237-240.