丝素蛋白复合物在骨缺损中的应用

王硕 韦兴

由于创伤、肿瘤或先天发育不足等原因导致人体的骨组织缺损较常见。这将导致骨骼的外形和功能出现缺陷，从而不同程度地影响患者的生活质量，因此骨缺损的修复一直是骨外科临床中关注的焦点之一。其中对于较大范围的骨缺损，采用人工材料填充骨缺损的手术已成为目前研究的热点。它几乎可以避免自体骨及同种或异体骨移植的大多数问题。而对于人工材料的主要问题仍是探求理想的骨移植替代材料。丝素蛋白是一种天然高分子纤维蛋白，文献证明它不仅具有良好的生物相容性和降解性能，还有易加工修饰、降解产物无毒性和低免疫原性等特点，并且丝素蛋白 ( silk fibroin，SF ) 材料的机械强度也明显优于其它生物材料。因此，许多研究者将成骨种子细胞和丝素蛋白结合起来制备具有骨修复能力的丝素蛋白材料，材料中的丝素蛋白可为细胞生长、黏附和分化提供所需的空间及环境。丝素蛋白骨修复材料的研发已经成为骨组织工程研究的热点之一。

一、丝素蛋白的生物学特性

我国是农业大国，蚕丝来源广泛，产量高。由于其降解性能好并有一定的机械强度，早已作为缝线应用在手术中。蚕丝丝线的成功应用已经让大家看到了其良好的生物相容性[1]。而在临床应用中，其外层包裹的丝胶蛋白可引起比较严重的过敏反应和异物反应[2]。生物材料植入体内后失败的一个主要原因就是引发免疫反应。有文献报道，将丝素蛋白放入老鼠皮下 8 周，可以引起轻微的炎性细胞刺激并增加吞噬细胞数量，显微镜下能看到一些吞噬细胞淋巴细胞[3-5]。轻微的炎性细胞刺激不会产生明显的不良反应，但是长期存在于人体内是否会有不良反应仍未证实。故有人将外层蛋白剥离，保留内层的丝素蛋白，从而避免了严重的过敏反应和异物反应[6]。

作为一个植入材料，降解性能是评价其好坏的重要指标，按照 Vert 等[7]的定义，生物降解是一个可植入聚合材料被生物元素降解成碎片的过程，它可以通过流体运输出去而并不一定从体内转运。另外，生物吸附也把最初的异物材料通过将其降解后，经过过滤和代谢完全排出。丝素蛋白具有良好的机械性能，蚕丝强度比钢高 10 倍[8]。由于骨细胞的细胞外基质中主要含有 I 型胶原和羟基磷灰石，这就需要骨组织的支架材料有较高韧性和机械强度。而丝素蛋白以稳定的反平行 β-折叠构象为基础，两种构象间可通过各种条件的改变来互相转变，这种结构决定了丝素蛋白在长轴方向强度很高，同时具有一定的延展性，其综合力学性能远高于普通合成纤维。

Wang 等[6]进行了蚕丝的体内降解实验，证明蚕丝材料植入大鼠体内几周后就开始分解，1 年后完全消失。丝素蛋白的降解产物是以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸为主的18 种人体氨基酸，不仅能进行生物降解还可以进行生物吸收，并对皮肤、牙周等组织有营养作用[7,9]。此外，丝素蛋白对氧和水有较强的通透性，这有利于细胞的黏附、增殖与分化。这是因为丝素蛋白肽链的 C 端亲水区附近类似精氨酸的氨基酸残基表面带有正电荷，这与细胞表面主要分布负电荷基团的哺乳动物异性相吸，因此更有利于细胞的黏附；另外丝素蛋白中大量的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列也常常是细胞吸附时的识别靶位[10-12]。

一个良好的骨缺损修复材料应该具备以下特点[13-14]：( l ) 良好的生物相容性；( 2 ) 可降解性和降解速率的可控性；( 3 ) 具有三维内联多孔隙结构、较高面积和体积比、良好的骨传导性及骨诱导性；( 4 ) 材料表面有利于细胞的吸附生长，利于细胞的分化；( 5 ) 有一定的机械强度及韧性；( 6 ) 易加工、易塑形、来源充足。目前丝素多孔支架已经被广泛应用于骨组织工程学[15]。丝素蛋白作为支架的植骨材料，具有来源广泛、产量高、生物相容性、降解性能、机械性能良好、过敏反应和异物反应低的特性，但还存在骨诱导、骨传导性能较低的问题，由于单一的材料不能满足植骨材料的所有需求，所以人们把目光转移到复合材料上，希望集合两种或多种材料的优势，互补其劣势，达到完美的性能组合。目前复合型骨缺损填充材料的研究及应用已成为骨组织修复替代材料研究的热点。Meinel等[16]首次将丝素蛋自制备成三维多孔丝素蛋白支架应用于骨组织工程研究，将人间充质干细胞 ( hMSC ) 种植于支架内植入鼠头盖骨创伤模型，发现植入后 5 周内能够诱导骨形成。这说明丝素蛋白可用于骨重建和再生，并且具有良好的力学稳定性和持久性。这个发现开启了人们应用丝素蛋白支架的复合材料研究，此后诸多学者利用复合材料的新思路，与其它组织材料相结合，希望其复合材料成为理想的骨缺损填充物。

二、丝素蛋白复合物

1. 与羟基磷灰石复合：从骨的组成和功能而言，天然骨组织主要是由无机纳米羟基磷灰石和有机胶原纤维构成的复合材料。体内骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，由两大部分构成：有机质和无机质。有机质 ( 主要是骨胶原纤维束 ) 作为骨的网状支架，赋予骨的弹性和韧性；而无机质 ( 主要是碱性磷酸钙结晶 ) 决定骨骼的硬度及刚性特征。纳米羟基磷灰石与丝素蛋白有机结合使得骨组织成为机体最坚硬的组织之一，在组成成分和结构上羟基磷灰石与骨骼、牙齿等一样，具有良好的生物活性和生物相容性。但该材料也存在一些不足之处，如不具有骨诱导性、脆性大、塑形差、降解速度慢等。纳米羟基磷灰石由于晶体重复周期少、结晶度低，比普通磷灰石在人体内更容易降解和吸收，并且对生物组织具有更高的表面活性。2001 年 Hartgerink 等[17]用胶原纤维与羟基磷灰石复合物进行实验动物骨缺损修复的研究，结果显示此复合物与天然骨相似，具有高度的骨传导活性，能诱导骨重建，可用于负重区骨缺损的修复。随后有众多学者对胶原纤维与羟基磷灰石复合物进行了研究。但由于 I 型胶原目前的主要来源是动物提取或人工合成，而动物来源存在免疫反应的风险，且人工合成胶原价格昂贵，所以限制了其在临床的广泛应用。

近年来国外报道[18]，将丝素蛋白作为无机物矿化的支架来诱导羟基磷灰石的晶体生长，其与纳米羟基磷灰石的复合物可以模拟天然骨组织，从而弥补单纯纳米羟基磷灰石力学性能的不足，并且大大减少了 I 型胶原导致的免疫反应。Bhumiratana 等[19]制得了羟基磷灰石与丝素蛋白复合材料，并通过改变丝素蛋白在材料中的比例，比较不同配比复合材料的微结构和理化性质的差异。鞠刚等[20]将丝素蛋白与羟基磷灰石制成复合材料，以兔子股骨滑车沟制作缺损模型，证明该复合材料有一定的骨缺损修复能力。2014 年，Kweon 等[21]制作羟基磷灰石与丝素蛋白复合 ( SH 组 )、羟基磷灰石与胶原蛋白复合 ( CH 组、HA 组 )材料并以空白为对照，以兔子胫骨为植骨模型，材料植入后 6 周 SH 组新骨形成率及骨结合率明显优于其余 3 组，证明该含丝素蛋白的复合材料的骨缺损修复能力高于羟基磷灰石和胶原蛋白组成的复合材料。丝素蛋白与羟基磷灰石复合的生物材料是类似正常骨组织的复合材料，有望成为理想的骨移植修复材料，但目前对于材料成骨后的生物力学测试强度及复合材料的骨诱导和骨传导的能力是否能达到正常骨组织的研究仍然较少。

2. 与磷酸钙骨水泥 ( calciurn phosphate cemeni，CPC )复合：20 世纪 80 年代，Brown 等[22]发明了 CPC，它是一种新型自固化生物活性材料，可被降解为羟基磷灰石( hydroxyapatite，HA )。因其具有良好的生物相容性、骨传导性、降解性和机械性能，曾考虑应用于植骨，但由于 CPC 力学强度低、脆性大、固化时间长、黏结性差、在生理环境中的抗疲劳强度不高，尤其是在湿环境下断裂韧性非常低，使其应用受到较大的限制[23-25]。因此，国内外学者纷纷致力于对上述问题的研究，将 CPC 与各种材料进行复合，如壳聚糖、可吸收纤维、聚合物等，但均未能取得突破性的进展[26]。解决 CPC 本身强度和脆性问题的关键是研制一种在保持良好的骨传导性的同时使其机械性能得到大幅度提高的材料，同时必须对磷酸钙有良好亲和力、可降解高分子，而丝素蛋白恰恰能符合这些要求。有研究报道[27]，在 CPC 中添加适量的丝素蛋白能增加其抗压强度，体外实验证实有良好的生物相容性。Pujiang[28]对于磷酸钙复合丝素蛋白应用于骨缺损进行了研究发现低结晶度的碳酸钙复合丝素蛋白后可在兔子体内成功修复骨缺损及韧带，并在体内外证实其明显的成骨作用。

3. 与间充质干细胞复合：关节软骨无血液供应和神经支配，损伤后几乎不能自发修复，通过构建生物特性与正常关节软骨相似的组织工程软骨是目前组织工程研究的热点之一。骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs ) 具有易于分离以及广泛的可塑性等特点。国外应用 BMSCs 治疗成骨不全和脂肪软骨营养障碍验证了移植 BMSCs 自发修复的能力[29]。Wakitani 等[30]首先实现了用间充质干细胞移植修复兔软骨缺损。但它仍存在不足，缺少一个有利于种子细胞黏附、增殖和分化的生物支架材料。丝素蛋正好弥补了 BMSCs 的作为植骨材料存在的这一缺点。实验表明[31]，经诱导的 BMSCs 与丝素蛋白复合在体内可形成透明软骨，并修复动物膝关节全层软骨缺损。这为临床上简便快捷地修复软骨缺损提供了基础。Jin 等[32]应用人的胎盘间充质干细胞 ( placentaderived mesenchymal stem cells，PMSCs ) 与丝素蛋白复合植入于大白兔桡骨缺损模型内，发现能提高组织的修复能力。间充质干细胞复合丝素蛋白有望成为骨组织工程的潜在来源。

4. 与壳聚糖复合：壳聚糖是自然界中少见的一种带正电荷的碱性多糖，它有良好的生物相容性。Lahiji 等[33]体外研究发现，壳聚糖不仅可促进成骨细胞增生，还能表达I 型胶原，其降解产物为氨基葡萄糖具较好的可塑形性、可被人体吸收并且还不会引起抗原反应。虽然壳聚糖已经广泛应用于医学领域，但作为植骨材料它存在机械性能差的缺点。柳嘉等[34]证实了，丝素蛋白与壳聚糖复合具有较好的生物相容性及成骨性能。然而制备孔隙率高、孔径适合成骨细胞生长、具有较好的骨传导性和骨诱导性的丝素蛋白与壳聚糖复合植骨材料，还需要进一步的研究[35]。

5. 与多种材料复合：丝素蛋白与常用植骨材料单独应用的研究还存在一定的缺陷，而 3 种材料混合制备的支架材料是否可以弥补各自的不足，是否甚至更加满足骨组织工程的需要呢？有学者对此提出了自己的看法。Lima等[36]也对丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石及其三者的复合材料进行了体外研究，将材料处理冻干并进行孔隙率、孔隙大小、热重量分析、扫描电镜观察等一系列理化性质检测，发现壳聚糖孔隙率最大，而三者的复合物在促进和维持成骨的分化方面最有优势。叶鹏等[37]将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石制成复合支架，认为1∶1∶1 制作的复合支架材料更符合骨替代材料的要求，但尚未进行动物实验进行证实。

虽然近期国内外学者对丝素蛋白在骨修复的应用进行了体内外等一系列研究，发现并证明了丝素蛋白作为植骨材料支架方面的诸多优势，但将其应用于临床治疗方面还有相当长的一段路要走。丝素支架能否完全与骨组织相匹配以及在体内的修复过程还需要长期观察。是否可以通过改变丝素蛋白内在的化学修饰等得到性能优良、具有临床应用价值的骨修复材料；能否找到与其它常用植骨材料相复合，从而达到骨诱导及骨传导活性强的要求，还需要进一步研究。

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