脑缺血预适应标志物的评估

苏芳，朱雨岚，郭安臣，王拥军1，，王群1，

脑缺血是世界范围内首要的致残及致死原因之一[1]。动物研究发现大量神经保护因子有效，但临床试验均无效。因此，人们致力于探索脑缺血的新的治疗策略，其中缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）受到广泛的关注。脑缺血预适应是对抗缺血性脑血管疾病的细胞保护策略，它通过短暂的缺血诱导固有的防御系统，引起对随后的严重缺血的耐受。例如，短暂阻断颈内动脉可保护随后的长时缺血并缩小梗死体积；远程IPC可保护远隔器官的更严重的缺血[2]。发现可能影响IPC的效应器及因子是IPC发展为临床试验的非常理想的目标。确定适合的标志物以表明预适应反应的诱发是转化研究的重点。因此，全面系统地研究缺血耐受的机体特点，从而确定发展适合的标志物，以表明神经保护治疗成功转化，具有重要的理论及临床意义。本文将对IPC的机制及可能的生物学标志物予以综述。

1 缺血预适应的保护机制

IPC是一种内源性神经保护机制，它诱导的缺血耐受存在于包括人、大鼠、小鼠、兔和猪等多种生物以及脑、肝脏、心脏、肾脏和脊髓等多种器官，这也证明了预适应反应的普遍性[3-6]。众所周知，IPC激活了广泛的不同的保护机制并且可抑制潜在的有害通路[7-8]。如IPC可以激活Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs），而TLR预处理可通过减少循环血中白细胞的活化、淋巴细胞对内皮的黏附、中性粒细胞的渗出、小胶质细胞的激活等减轻局灶脑缺血后的炎症反应而发挥保护作用[9]。其他研究在大鼠脑、心脏等靶组织发现了多种反应，例如热休克蛋白（heat shock protein，HSP）的表达，腺苷受体、一氧化氮代谢的上调等，并且将这些反应与组织保护关联[10-11]。总之，IPC诱导的保护作用基于以下几方面：细胞代谢稳态的改变[12]；线粒体代谢的调节[4]；防护兴奋性毒性损伤及缺氧/缺血去极化[13]；通过离子转运系统改善容量以保护细胞离子稳态及pH稳态[14]；抑制凋亡机制[15]；激活脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）修复及自我修复[16]；抑制炎症反应[17]；调节缺血再灌注阶段的血流及血管重塑[18]。

IPC可以分为发生于亚致死性损伤后数分钟并持续几小时的早期阶段及发生在24～48 h后持续数天至数周的晚期阶段[19]，这两阶段有不同的保护机制。预适应反应开始阶段包括许多触发机制，如细胞因子[20]、腺苷受体[21]、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）-敏感钾通道[22]及氧化应激等。IPC后早期再灌注，神经保护反应通过蛋白转录后修饰快速启动，晚期阶段依赖于基因表达和蛋白质的从头合成[19]，而晚发阶段新合成的蛋白质有可能成为神经保护治疗成功的标志物。

这些临床前研究，明确了预适应反应的重要通路，但它们很难作为预适应反应的标志物，因为它们大多需要直接有创的组织检测，而这些很难在人脑、心脏等器官实现，但它们为临床标志物的进一步发展和试验指明了方向并提供了理论依据。

2 临床缺血预适应模型

大部分在体IPC模型是啮齿类动物模型，通常是有创的，很难转化成临床应用。然而，一种IPC改进的形式——远隔缺血预适应（remote ischemic preconditioning，RIPC）被证明具有高度的转化价值[23]。RIPC包括周期性暂时阻断和再恢复远离细胞保护靶器官的肢体血流。在这一区域反复的周期性暂时缺血可以触发可溶性保护因子释放入血液，并分布到靶器官发挥保护作用[24]。如，临床试验使用血压袖带暂时阻断和恢复患者上肢或大腿血流，因此称为RIPC模型之一[25]。RIPC处理后的冠状动脉旁路移植术患者，射血分数、移植物通畅及心电图参数均有所改善[26]。研究证实RIPC在严重蛛网膜下腔出血患者中也是安全且耐受的[6]，因此RIPC可能是一种易行的预防性治疗方法。RIPC确切的保护机制尚不清楚。

3 临床缺血预适应生物标志物的评估

缺血耐受状态生物标志物的发展具有重大的临床和科学意义，基于以往实验确定的信号通路及机制，人们已经开始评估人类对预处理的生物反应。而卒中时预适应反应可能标志物的临床研究相对较少。鉴于预适应众多的生物学作用，识别血清标志物、确定缺血耐受状态的存在似乎是可能的。血清标志物易于检测，可重复，并且可商业化，有较好的临床应用前景，一直以来都是研究的热点。迄今为止大多数的临床研究通过研究血清止血、内皮细胞功能、炎症反应及影像学标志等来评估人类对预适应的反应。

3.1 止血标志物 研究表明预适应对涉及凝血级联反应的止血、纤溶支持蛋白的基因表达有广泛的作用，这些蛋白可作为预适应反应潜在的标志物[27]。在健康志愿者蛋白质组研究中，Hepponstall等[28]对5位健康志愿者上肢进行4次（每次5 min）循环的缺血预处理，涉及止血、免疫反应、抗炎、氧化应激抑制、内皮细胞活化等多种蛋白质的表达发生了改变。例如，RIPC组纤维蛋白原β（fibrinogen beta，Fgβ）下调，而Fgβ是止血蛋白，可以促进缺血再灌注时血小板的黏附，它的下调可能与RIPC的保护作用有关，因此Fgβ可能作为IPC潜在的标志物。Pedersen等[29]对22例健康志愿者进行上肢3次（每次5 min）循环缺血预处理，结果发现预处理不影响血清纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）和tPA抑制剂抗原及活性。但是该研究给予预处理刺激及进行血清分析的时间间隔相对较短（缺血预处理30 min内给予评估），如延长分析时间，预适应对这些蛋白的延迟作用仍可能存在。还有研究表明，RIPC可抑制人缺血再灌注损伤相关的血小板的活化[30]。Oberkofler等[31]在鼠的研究中发现血小板-血清素-血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-白细胞介素（interleukin，IL）-10/基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinste，MMP）-8轴介导了RIPC的保护作用。而血小板活化的标记是否能可靠地衡量预适应反应尚需进一步的研究确认。

3.2 内皮及血管活性因子 Park等[32]对沙土鼠的研究发现，IPC可显著增强缺血再灌注后CA1区锥体细胞VEGF的诱导及其受体的免疫活性，该研究提示VEGF的表达增加可能对于短暂性缺血性损伤细胞的存活是必需的。Kimura等[33]评估了IPC对血管活性和内皮因子的影响，健康志愿者接受为期1个月，每天4次（每次5 min）重复的前臂缺血预适应，发现IPC可引起血浆VEGF水平及内皮祖细胞升高，提示重复的IPC刺激可增强内皮依赖的血管舒张，IPC是周围血管保护的一个简单、安全易行的治疗技术，而血浆VEGF的升高可作为预适应反应发生的潜在的标志物。还有学者提出了一些血管活性物质例如一氧化氮的活化、缓激肽等介导了IPC反应，但由于这些物质难于检测，目前少有关于预适应如何影响这些物质水平的临床研究。

3.3 炎症标志物 大部分评估人类预适应反应的临床工作仅涉及免疫和炎症系统。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）过表达与脑梗死前短暂缺血中实验性缺血耐受相关。Castillo等[34]检测了283例脑梗死患者症状出现后24 h内血浆TNF-α及IL-6的浓度。其中卒中前72 h内短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）的患者38例，脑梗死的体积及预后（Barthel指数）均显著低于无前驱TIA的患者。有前驱TIA的患者，血浆TNF-α升高、IL-6降低。当TNF-α高于30 pg/ml，IL-6低于30 pg/ml，认为一个新的变量TNF-α/IL-6指数为阳性，阳性TNF-α/IL-6指数存在于92%的脑梗死前患有TIA患者，而脑梗死前无TIA的患者中仅1%。TNF-α/IL-6指数增高与脑梗死预后的改善相关。Saxena等[35]对冠状动脉旁路移植术患者术前上肢缺血预处理，结果发现可以下调中性粒细胞激肽B1和B2受体的表达，但血浆C反应蛋白无明显变化。目前少有临床试验检测脑缺血预处理中C反应蛋白等的变化，有待进一步的研究。

3.4 其他血清标志物 钙连接蛋白B（S100 calcium binding protein B，S100B）是评估中枢神经系统损伤（脑外伤、脑梗死、脊髓疾病等）严重程度的生物标志物之一，也是较早被研究的急性脑梗死的标志物之一。主要由星形胶质细胞分泌，是脑内特异蛋白，生物学功能包括调钙作用、细胞代谢、抑制磷酸化等。缺血性卒中发生后血清S100B蛋白浓度增加，且与脑梗死体积呈正相关[36]。有研究表明，脊髓型颈椎病患者颈椎减压术前给予上肢缺血预处理，可降低外周血S100B水平，患者预后较好[37]。关于脑缺血预适应中S100B的变化，其是否能够反映缺血耐受状态的发生、是否有较好的剂量-效应关系少有报道，尚需进一步的试验来评估其是否可作为IPC的敏感、特异的标志物。

微小RNA（microRNA，miRNA），是生物体内具有重要调控作用的非编码小RNA，在许多病理生理条件下，表达发生改变。缺血耐受需要新蛋白质的合成，引起大脑对随后的缺血反应的基因重组，miRNA通过直接作用于信使RNA（messenger ribonucleic acid，mRNA）调节转录后基因表达。Lusardi等[38]研究表明IPC调节大鼠大脑皮质miRNA表达，提示miRNA作为IPC诱导的缺血耐受的效应器。目前关于人类IPC诱导的缺血耐受状态下的miRNA表达的变化研究较少，由于血液中miRNA易被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）降解，临床采集标本需严格注意，且RNA提取检测过程需时较长、费用过高，这些特点限制了其发展，miRNA是否能作为IPC的标志物，尚需进一步研究探索。

3.5 影像学标志物 除血清标志物外，还可通过血流、灌注成像及血管舒缩测试、脑电图等来评估IPC反应。IPC的重要生理作用包括增加靶器官的血流。在局灶脑缺血动物模型，预处理增加缺血半暗带区的脑血流。Vlasov等[39]通过高频多普勒超声仪探测缺血预处理的缺血再灌注大鼠的脑血流量，结果发现早期和晚期预处理可增加大鼠脑缺血后的脑血流量。数项临床研究评估了IPC的血流改变，Meng等[40]纳入68例症状性颅内动脉狭窄患者进行研究，所有患者接受标准的医疗管理，其中38例接受连续300 d，每天2次5个循环反复双上肢缺血预处理，单电子发射计算机断层扫描（single photon emission-computed tomography，SPECT）及经颅多普勒检查发现与对照组比较预处理患者脑灌注及血流增加，300 d时对照组卒中复发率为26.7%，而预处理组仅为7.9%。Jensen及其团队研究了与临床非常相关的猪深低温停循环模型中RIPC的作用，研究发现循环骤停前1 h给予后肢4次（每次5 min）循环的缺血-再灌注，引起脑乳酸降低、脑电图快速恢复及行为学评分的改善[41]。Gonzalez等[42]最近报道了远程处理对蛛网膜下腔出血患者发病后2周血管痉挛高峰期血流动力学及脑代谢的作用，在蛛网膜下腔出血后2～12 d对患者进行3～4周期的下肢RIPC，每周期4次（每次5 min）循环的缺血-再灌注，发现RIPC可引起短暂的血管舒张，改善了患者的脑血流动力学（经颅多普勒），降低乳酸/丙酮酸的比例（微量透析）以及丙三醇，改善脑代谢，提示缺血保护及细胞膜保护作用。这将打开在因临床目的需要进行有创监测的重症患者中仔细监测对预适应的代谢反应的可能。

综上所述，发现代表IPC诱导的缺血耐受状态的标志物具有较高的临床意义及科学价值。目前已有大量的研究确定了预适应反应的信号通路，其中一些因子已被选择性用于生物标志物发展的临床研究。理想的标志物不仅需要有较高的敏感性、特异性，易于获得，还应该能够体现出对刺激的早期反应，体现剂量-效应关系，与保护机制相联系。寻找合适的生物标志物以精确衡量IPC反应方面仍有许多挑战，识别内源性缺血耐受状态可显著促进血管疾病方面细胞保护领域的发展。然而考虑到这一现象的复杂性，未来尚需更多这类的临床研究，以发现更多的标志物或标志物的组合。

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【点睛】

IPC是对抗缺血性脑血管病的细胞保护策略，确定适合的标志物以表明神经保护治疗成功转化具有重要的意义。