缺血性卒中模型选择及临床前实验设计

王群，王拥军

缺血性卒中由于病因、病程、阻塞部位、缺血程度及合并系统疾病的差异而导致临床变异性很大，使得临床研究需要较多的样本量以避免混杂因素的影响，而这些可变量在动物模型中可以得到严格控制[1]。实验性脑缺血模型已经被用来模拟人类卒中，它在认识缺血性脑损伤的病理机制，发展新的治疗策略方面发挥着重要作用[2]。缺血性卒中的治疗策略可以分为两个主要方面：溶栓和神经保护。目前，重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一获得美国食品药品管理局批准的急性缺血性卒中的治疗药物，其溶栓疗效首先在实验性动物模型中得到证实[3]。尽管在动物模型中，许多药物显示有神经保护作用，但从动物到临床的转化研究中则未能显示同样的效果[4]，可能与动物模型不能真正代表疾病的状态[5]或药物在动物和患者身上的应用差异有关[6]。

为了解决这一困惑，美国第一届卒中治疗学术工业圆桌会议（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）规范了临床前期实验的统一标准，对药物治疗的剂量、时间窗、动物选择、模型选择、生理指标监测和疗效评定进行了界定。临床前研究应首先在啮齿类小型动物中进行，而相关药物研究还应该考虑在多脑回的灵长类大动物中展开[7]。第六届STAIR对此规范进行了补充升级[8-9]：①消除在动物随机化和疗效评估中的偏见；②制订动物入组和排除标准；③适当的统计学方法计算动物样本数；④公布潜在的利益冲突；⑤在年幼、健康和雄性动物完成起始实验后，应进一步选择雌性、老龄和伴随高血压、糖尿病和高血脂的动物进行实验[10]；⑥在动物研究中应用与临床相关的生物指标。

一个可靠的缺血性卒中模型必须能够诱导高度一致的脑损伤，避免其他因素影响结果判定，并能被广泛利用。为此美国实验卒中协会于2009年为卒中的临床前期实验公布了第一版卒中模型指南。在开始临床前期卒中实验以前，要求遵守以下步骤[11]：①复习最近的STAIR标准以期达到最佳的研究设计；②选择最适当的卒中模型；③确定卒中模型的参数，如预期的梗死灶大小和手术程序；④确定麻醉方法；⑤确定吸入气体的成分；⑥确定插管和通气的必要性和设置；⑦建立动脉血压、血气和血糖监测；⑧建立体温监测和维持；⑨建立区域性脑血流监测；⑩确定术后动物照料规程； 确定梗死灶体积测量的方法和时间； 确定功能缺失评估的实验方法和时间； 通过预实验调整实验设置到最优化； 以药物非临床研究质量管理规范（good laboratory practice，GLP）评估实验的顺应性。

在可靠的实验模型中何时开始评价，如何评价治疗策略，针对这个问题，以往大多数的局灶性脑缺血损伤是在急性期即在缺血24 h检查组织病理结果。然而由于迟发性脑损伤及神经再生的发展，STAIR建议神经保护剂的结果评价应该包括急性期（1～3 d）和长时程（1～4周）评估[7]。评价缺血性神经损伤的方法很多，STAIR建议至少应该考虑两种评价方法，即组织病理改变和功能反应[7，12]。现对常用的评价方法做一介绍。

1 区域脑血流监测

激光多普勒血流分析仪，可将激光探头固定于颅骨上，只要保证激光探头在整个实验过程中无位置移动及转动，即可准确地测定该部位的血流量[13-14]。应用激光多普勒监测局灶和全脑缺血的脑血流量，只有当区域脑血流监测平均降低70%～80%时才能符合模型成功标准[14-15]。

2 脑电图记录

脑电图较神经影像对脑缺血更敏感，反应更早[16-17]。分别在动物颅骨的左右两侧对称地放置脑电极，电极尖端穿过颅骨接触硬脑膜，用牙科黏合剂固定，参考电极安置在鼻骨正中。可以反映阻断侧大脑中动脉供血区、非供血区以及对侧相应部位的脑电变化。若应用脑电图仪，可放置更多的电极，能更准确地反映脑缺血的范围以及程度。缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢。记录并测量栓塞前、栓塞后和复灌后的脑电图的波幅。通常将脑电图变化依其幅度下降程度分为Ⅳ级。Ⅰ级：无改变，原水平的75%以上；Ⅱ级：轻度抑制，原水平的50%～75%；Ⅲ级：中度抑制，原水平的25%～50%；Ⅳ级：严重抑制，原水平的25%至等电位。

3 行为学评价

功能恢复是临床药物研究的最终目标[18-19]，因此选取何种指标评价脑缺血的程度及药物的疗效尤为重要。为了减少主观偏见，采用盲法评估功能反应很有必要[11]。必要时行为学测试应该安排在脑缺血1个月后进行[7]。

3.1 神经功能缺损评估 模型制备成功后会出现相应的症状与体征，这些症状与体征反映了脑损伤与恢复的程度，可作为模型成功的标志。神经功能分级通常用来量化神经功能缺失评估。其分级必须能够检查脑缺血诱导的运动、感觉、运动协调、自发性活动、反射、意识和警觉变化。一般采用Zea Longa[20]、Bederson[21]、Rogers[22]分数量表法按受损程度分级。如Zea Longa 5分制评分标准为[20]：0分，无神经损害的症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒：4分，不能自发行走，意识丧失。

3.2 大鼠记忆定位功能评价 动物脑中参与学习和记忆的部位不仅限于海马，皮质尤其是顶叶皮质在动物的学习和记忆过程中起到非常重要的作用，术后顶叶皮质的损伤会导致大鼠的学习记忆能力降低。对此常用的检测方法为水迷宫试验[23]。

3.3 运动协调能力评价 运动的调控是在运动系统分级调控的基础上通过反馈机制调整缓慢的运动或姿势的维持，通过前馈控制来控制快速的动作。常用的方法有攀绳实验[24]和肢体对称试验[25]等。

4 脑表面血管的观察

印度墨汁-明胶溶液心内注射后随脑血流入脑循环。在显微镜下可清晰显示脑表面的血管结构、大小及走向。结合激光多普勒监测脑血流，可以剔除具有后交通动脉的动物，从而提高结果的一致性[15，26]。

5 梗死灶大小测量

动物断头取脑，冠状位切片，迅速将脑片置于2，4，5-三苯基四氮唑染液中，37℃避光温孵30 min，取出后置于10%甲醛溶液中避光保存24 h，经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗死区为白色。可以对脑片进行计算机图像分析，观察计算大鼠脑梗死灶的范围[27]。

6 白细胞、血小板与血管内皮细胞黏附反应

脑微循环研究的进展依赖于尖端技术的进步。现在通过高性能的荧光显微镜和高灵敏度的录像和快速图像处理系统（Intravital Fluorescence Microscopy and Video Analysis），已能对脑微循环内循环细胞和内皮细胞之间的作用进行直接动态活体观察、测量和分析[28-29]。一般先通过静脉注射荧光物质标记白细胞或血小板，然后应用该系统并结合颅骨窗技术，对软脑膜微循环中白细胞或血小板的滚动（rolling）、黏附（adhesion）和其与内皮细胞的接触时间（adhesive contact time）进行研究[30]，旨在了解神经保护剂对脑缺血再灌注引起的脑微循环障碍的影响。

7 血脑屏障通透性

动物尾静脉注射偶氮蓝溶液，制作脑缺血模型后断头取脑。然后将脑放入盛有甲酸胺溶液的试管中浸泡。取出后用分光光度计进行浸出液比色，测定光密度。再以标准曲线对照，继而计算出单位脑重的偶氮蓝含量，以此评价血脑屏障通透性[31]。

8 脑水肿测量[32]

通过脑水肿的测量观察脑缺血损伤后脑组织水肿情况。一般在缺血模型复制后24 h，快速剥出鼠脑，将左右大脑半球分别称重，然后置烤箱内烤干至恒重（5 d后两次检查）。分别称量大脑半球干重，按以下公式计算大脑半球的含水量。含水量（%）=（湿重－干重）／湿重×100%。

9 组织病理改变

苏木精伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）和甲酚紫（Cresyle violet）染色是传统的组织病理检查方法，可以精确可靠地区别梗死组织和正常组织，损伤神经元和正常神经元，是鉴别梗死灶和损伤神经元的金标准[15，33-34]。可采用光学显微镜或电子显微镜研究镜下的组织细胞形态学改变。Flouro-Jade B组织荧光染色阳性说明神经元变性损伤。原位末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end Labeling assay，TUNEL）组织染色是确定神经元程序性死亡（凋亡）的金标准[35]。微管相关蛋白-2免疫组织化学染色可以观察神经元突起的损伤状况[36]。另外，利用双光子显微技术（2-photon microscopy）也可以在活体卒中动物模型中检测到精细的突触动态结构变化[37]。

10 神经生化测定

取脑组织称重后制成匀浆，取离心后上清液采用相应的方法，检测各项指标脑组织内神经递质、血管活性物质及其他生物活性物质[31，36]。亦可活体收集微透析液，与高效液相色谱或毛细血管电泳仪连用，观测脑组织神经递质等神经活性物质的动态变化[38]。

11 蛋白和基因表达的检测

应用免疫组化、蛋白印迹或蛋白质组学方法检测脑内重要功能蛋白的含量[39-40]。采用原位聚合酶链反应、原位杂交或其他杂交方法及基因组学方法，可观察基因的表达[41-43]。不仅有利于对脑缺血病理生理机制的深入探讨，而且有利于对神经保护剂确切疗效的评价。

12 神经影像

国外研究[44]已将磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）弥散加权像（diffusion weighted imaging，DWI）和T1、T2加权像用于大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型研究。DWI在缺血损害的早期阶段，就能区分缺血组织与正常组织，从而早期进行模型评价[45]。MRI灌注加权像（perfusion weighted imaging，PWI）可检测局部脑血容量、局部脑血流量等生理和血流动力学资料。DWI及PWI能在脑缺血早期显示病灶大小和部位，DWI反映的是脑细胞损伤的病理状态，PWI反映了血流动力学的变化[46]。且MRI具备无创伤性的特点，可以动态观测大鼠脑缺血损害的时间变化趋势以及梗死灶的大小。近年来，分子图像广泛应用于啮齿类动物脑缺血研究。采用MRI分子图像技术成功在小鼠MCAO模型中检测到血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表达，脑的预适应保护减少了脑缺血再灌注诱导的VCAM-1表达，改善了行为异常[47]。提示分子MRI技术可用于病情评估及治疗监测。最近，微小计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）被应用于啮齿类动物脑缺血研究[48]，其图像的空间和对照分辨率及用于梗死灶体积测量的精确性与MRI相当[49]。

鉴于缺血性脑血管疾病发病率高且是现今医药研究课题的重点、热点，我们在基础医学研究以及评价各类药物、化合物的药理作用，分析其作用机理的研究中，难免会经常使用各种缺血性脑血管疾病动物模型和不同评价缺血性神经损伤的方法。模型选择必须按照课题研究的要求，选定与人类脑缺血性疾病发病机制等接近的动物模型，确定对临床研究或药效药理研究有明确指导意义的评价缺血性神经损伤的指标，以达到研究目的。全面考虑各种因素对模型的影响，建立重复性好，生理指标控制严格的标准化脑缺血动物模型并选用急性期和长时程评价指标，是研究缺血性脑损伤及脑保护必不可少的工具。

1 Durukan A, Tatlisumak T. Acute ischemic stroke：Overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2007, 87：179-197.

2 Macrae IM. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia[J]. Br J Pharmacol, 2011, 164：1062-1078.

3 del Zoppo GJ. Relevance of focal cerebral ischemia models. Experience with fibrinolytic agents[J]. Stroke,1990, 21：IV155-IV160.

4 Willing AE. Experimental models：Help or hindrance.Stroke, 2009, 40：S152-S154.

5 Slikkker W, Youdim M, Palmer GC, et al. The future of neuroprotection[J]. Ann N Y Acad Sci, 1999, 890：529-533.

6 Richard Green A, Odergren T, Ashwood T. Animal models of stroke：Do they have value for discovering neuroprotective agents?[J]. Trends Pharmacol Sci, 2003,24：402-408.

7 Saver JL, Albers GW, Dunn B,et al. STAIR VI Consortium. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR). Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development[J]. Stroke, 1999, 30：2752-2758.

8 Fisher M, Feuerstein G, Howells DW, et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations[J]. Stroke, 2009, 40：2244-2250.

9 Macleod MR, Fisher M, O'Collins V, et al. Good laboratory practice：Preventing introduction of bias at the bench[J]. Stroke, 2009, 40：e50-e52.

10 Fan X, Qiu J, Yu Z, et al. A rat model of studying tissuetype plasminogen activator thrombolysis in ischemic stroke with diabetes[J]. Stroke, 2012, 43：567-570.

11 Liu S, Zhen G, Meloni BP, et al. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition)[J]. J Exp Stroke Transl Med, 2009, 2：2-27.

12 Durukan A, Strbian D, Tatlisumak T. Rodent models of ischemic stroke：A useful tool for stroke drug development[J]. Curr Pharm Des, 2008, 14：359-370.

13 Harada H, Wang Y, Mishima Y, et al. A novel method of detecting rcbf with laser-Doppler flow metry without cranial window through the skull for a MCAO rat model[J]. Brain Res Brain Res Protoc, 2005, 14：165-170.

14 Prieto R, Carceller F, Roda JM, et al. The intraluminal thread model revisited：Rat strain differences in local cerebral blood flow[J]. Neurol Res, 2005, 27：47-52.

15 Wang Q, Xu J, Rottinghaus GE, et al. Resveratrol protects against global cerebral ischemic injury in gerbils[J]. Brain Res, 2002, 958：439-447.

16 Kohno K, Back T, Hoehn-Berlage M, et al. A modified rat model of middle cerebral artery thread occlusion under electrophysiological control for magnetic resonance investigations[J]. Magn Reson Imaging, 1995,13：65-71.

17 Huang L, Wang Y, Liu J, et al. Approximate entropy of eeg as a measure of cerebral ischemic injury[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004, 6：4537-4539.

18 Schaar KL, Brenneman MM, Savitz SI. Functional assessments in the rodent stroke model[J]. Exp Transl Stroke Med, 2010, 2：13.

19 Zarruk JG, Garcia-Yebenes I, Romera VG, et al.Neurological tests for functional outcome assessment in rodent models of ischaemic stroke[J]. Rev Neurol, 2011,53：607-618.

20 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20：84-91.

21 Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion：Evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke,1986, 17：472-476.

22 Rogers DC, Campbell CA, Stretton JL, et al. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J]. Stroke, 1997, 28：2060-2066.

23 D'Hooge R, De Deyn PP. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory[J].Brain Res Brain Res Rev, 2001, 36：60-90.

24 Ding Y, Zhou Y, Lai Q, et al. Long-term neuroprotective effect of inhibiting poly(adp-ribose) polymerase in rats with middle cerebral artery occlusion using a behavioral assessment[J]. Brain Res, 2001, 915：210-217.

25 Bland ST, Schallert T, Strong R, et al. Early exclusive use of the affected forelimb after moderate transient focal ischemia in rats：Functional and anatomic outcome[J].Stroke, 2000, 31：1144-1152.

26 Zhen G, Dore S. Optimized protocol to reduce variable outcomes for the bilateral common carotid artery occlusion model in mice[J]. J Neurosci Methods, 2007,166：73-80.

27 Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, et al. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J]. Stroke, 1986, 17：1304-1308.

28 Gavins F, Yilmaz G, Granger DN. The evolving paradigm for blood cell-endothelial cell interactions in the cerebral microcirculation[J]. Microcirculation, 2007,14：667-681.

29 Ishikawa M, Zhang JH, Nanda A, et al. Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation[J]. Front Biosci, 2004, 9：1339-1347.

30 Wang Q, Kalogeris TJ, Wang M, et al. Antecedent ethanol attenuates cerebral ischemia/reperfusioninduced leukocyte-endothelial adhesive interactions and delayed neuronal death：role of large conductance Ca2+-actinated K+channels[J]. Microcirculation, 2010, 17：427-438.

31 Gidday JM, Gasche YG, Copin JC, et al. Leukocytederived matrix metalloproteinase-9 mediates bloodbrain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289：H558-H568.

32 Yang G, Chan PH, Chen SF, et al. Reduction of vasogenic edema and infarction by mk-801 in rats after temporary focal cerebral ischemia[J]. Neurosurgery,1994, 34：339-345.

33 Lin TN, Wang Q, Simonyi A, et al. Induction of secretory phospholipase a2 in reactive astrocytes in response to transient focal cerebral ischemia in the rat brain[J]. J Neurochem, 2004, 90：637-645.

34 Garcia JH, Liu KF, Ho KL. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex[J]. Stroke, 1995, 26：636-643.

35 Wang Q, Sun AY, Simonyi A, et al. Oral administration of grape polyphenol extract ameliorates cerebral ischemia/reperfusion-induced neuronal damage and behavioral deficits in gerbils：Comparison of pre- and post-ischemic administration[J]. J Nutr Biochem, 2009,20：369-377.

36 Wang Q, Sun AY, Simonyi A, et al. Ethanol preconditioning protects against ischemia/reperfusioninduced brain damage：Role of NADPH oxidase-derived ros[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 43：1048-1060.

37 Sigler A, Murphy TH. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain：Before, during, and after stroke[J]. Stroke, 2010, 41：S117-S123.

38 Van Hemelrijck A, Sarre S, Smolders I, et al.Determination of amino acids associated with cerebral ischaemia in rat brain microdialysates using narrowbore liquid chromatography and fluorescence detection[J]. J Neurosci Methods, 2005, 144：63-71.

39 Barone FC, White RF, Spera PA, et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance：Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression[J]. Stroke, 1998, 29：1937-1950,discussion 1950-1931.

40 Datta A, Jingru Q, Khor TH, et al. Quantitative neuroproteomics of an in vivo rodent model of focal cerebral ischemia/reperfusion injury reveals a temporal regulation of novel pathophysiological molecular markers[J]. J Proteome Res, 2011, 10：5199-5213.

41 Iadecola C, Ross ME. Molecular pathology of cerebral ischemia：Delayed gene expression and strategies for neuroprotection[J]. Ann N Y Acad Sci, 1997, 835：203-217.

42 Slevin M, Krupinski J, Kumar P, et al. Gene activation and protein expression following ischaemic stroke：Strategies towards neuroprotection[J]. J Cell Mol Med, 2005, 9：85-102.

43 Stenzel-Poore MP, Stevens SL, Simon RP. Genomics of preconditioning[J]. Stroke, 2004, 35：2683-2686.

44 Hoehn M, Nicolay K, Franke C, et al. Application of magnetic resonance to animal models of cerebral ischemia[J]. J Magn Reson Imaging, 2001, 14：491-509.

45 Sevick RJ, Kucharczyk J, Mintorovitch J, et al. Diffusionweighted MR imaging and T2-weighted MR imaging in acute cerebral ischaemia：Comparison and correlation with histopathology[J]. Acta Neurochir Suppl (Wien),1990, 51：210-212.

46 Tatlisumak T, Strbian D, Abo Ramadan U, et al. The role of diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in drug development for ischemic stroke：From laboratory to clinics[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2004,2：343-355.

47 Hoyte LC, Brooks KJ, Nagel S, et al. Molecular magnetic resonance imaging of acute vascular cell adhesion molecule-1 expression in a mouse model of cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010, 30：1178-1187.

48 McLeod DD, Parsons MW, Levi CR, et al. Establishing a rodent stroke perfusion computed tomography model[J].Int J Stroke, 2011, 6：284-289.

49 Hayasaka N, Nagai N, Kawao N, et al. In vivo diagnostic imaging using micro-CT：Sequential and comparative evaluation of rodent models for hepatic/brain ischemia and stroke[J]. PLoS One, 2012, 7：e32342.