基于荧光素汞荧光法结合光纤传感—微顺序注射—阀上实验室测定肠灌流液中H2S

侯俊峰+关明+李新霞

摘 要 建立基于光纤传感技术结合微顺序注射-阀上实验室荧光猝灭测定肠灌流液中H2S含量方法。本研究进行单因素考察，确定以100 μL 0.1mol/L NaOH溶液为载液，荧光素汞浓度为5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L、体积50 μL、进样体积50 μL、流通池检测流速25 μL/s，根据H2S猝灭荧光素汞521 nm处荧光，对样品中H2S浓度进行测定。本方法检测H2S的浓度范围为5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L，检出限为5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L。测定肠灌流液中H2S含量为3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L，RSD=3.1%（n=3）。本方法能有效在线测定样品中H2S含量，为实时在线测定生物样品中的H2S含量奠定基础。

关键词 光纤传感 硫化氢 微顺序注射-阀上实验室 荧光素汞 荧光猝灭

1 引 言

硫化氢（H2S）是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，是空气和水源的污染物之一。近研究发现，H2S是继NO和CO之后又一种新型信号分子，作为一种活性神经调节物质广泛存在于动物体内，参与并调节动物体诸多的生理病理活动[1]。目前，H2S的测定方法大多局限于传统方法，如亚甲基蓝法[2]、硝酸银比色法[3]、气相色谱法[4]等。这些传统的方法检出限和灵敏度无法满足生物样品中极微量甚至痕量H2S测定要求。而荧光法的灵敏度更高，测定H2S数量级达到10 Symbolm@@ 6 mol/L。荧光素汞具有很强荧光，H2S中S2 Symbolm@@ 与荧光素汞结合，使荧光素汞荧光猝灭，H2S含量与荧光素汞的荧光强度具有良好的相关性。

微顺序注射-阀上实验室（MicroSIA Lab-on-valve，μSIA-LOV）是第三代流动注射分析技术[5]，在μSIA-LOV分析系统中，所有的单元操作，如样品稀释、试剂试样的加入、混合以及多种连用技术的结合，使得整个实验测定过程能够可控、高效地进行。该系统能将试剂及样品消耗降低至微升水平，减少了试剂的使用量，适用于长时间监测和试剂比较昂贵、样品来源受限的分析。LOV系统不仅可以与光纤传感结合，也可以灵活与电化学[6]、色谱[7]、化学发光[8]、固相萃取[9]、原子荧光[10]等方法联用。

本研究将光纤传感技术与微量顺序注射-阀上实验室（μSIA-LOV）结合，以光纤作为传导介质，将光纤光谱仪、微顺序注射分析仪八通阀和氙灯光源连接，用计算机控制，利用该系统自动介观流控特征与光纤传感的实时监测相连，可以实现样品的在线监测。本研究以Na2S为供体，建立光纤传感-微量顺序注射-阀上实验室检测肠灌流液中H2S的分析方法，为进一步进行动物在体肠灌流H2S或H2S供体药物的肠吸收特性研究奠定分析基础。

2 实验部分

2.1 实验装置

微量顺序注射仪（美国FIAlab Instruments公司）;光纤光谱仪（QE65000-FL，CCD）、连续氙灯光源（HPX-2000）、200 μm×1 m光纤两根均为美国Ocean optics公司产品。PB-10型pH计（德国Sartorius公司）;实验流路所用连接管道采用PTFE管（0.75 mm，I.D.）。分别采用安装有FIAlab for Windows和SpectraSuite 软件的Windows XP系统台式电脑对微量顺序注射分析仪和光纤光谱仪进行控制。光纤传感-微顺序注射-阀上实验室仪器装置：包含一个1000 μL高精密度注射泵、一个棕色滤光8通道的多位阀模块（LOV），在该模块上集成了一个中心控制通道、多个工作通道及一个多功能流通池等操作单元;通过软件调节控制中心通道一端与8位阀上联通位置，使中心通道与工作通道准确连接，另一端与高精度注射泵相连而构成流动分析系统。一根光纤与光谱仪相连，另一根光纤与氙灯光源相连，两根光纤探头插入LOV流通池接口，光路垂直组成荧光测定模式。

2.2 试剂及溶液配制

荧光素汞（优级纯， 美国化学服务公司）;Na2S·9H2O（分析纯， 天津市福晨化学试剂厂）;其余试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

准确称取0.0159 g荧光素汞，用0.1 mol/L NaOH定容到100 mL棕色容量瓶中，浓度为1.874×10 Symbolm@@ 4 mol/L，冷藏备用，使用时稀释到所需浓度。准确称取0.240 g Na2S·9H2O，用水溶解并定容到100 mL，浓度为0.01 mol/L， 4 ℃密封保存备用，使用时用水稀释到所需浓度。

Kreb-Ringer′s（KR）营养液：准确称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g于1000 mL容量瓶中，用水定容，4 ℃保存备用。

系列浓度H2S肠灌流液的配制：将0.01 mol/L Na2S溶液用KR营养液稀释10倍（1.0 mmol/L），再分别取稀释液0， 0.05， 0.1， 0.15， 0.2和0.25 mL于5 mL容量瓶中，用KR营养液定容。

供试品溶液：由KR营养液配制的Na2S溶液（5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），健康大鼠麻醉后，将KR营养液由活体空肠灌流（蠕动泵流速0.2 mL/min） 30 min，接取供试品溶液于5 mL EP管中，封口4 ℃保存，待测。

2.3 操作流程

实验流路如图1所示，在注射泵的驱动下，首先由多位阀的6号口吸入适量载液（0.1 mol/L NaOH），7号口以50 μL/s的速度先后从中心通道吸入50 μL荧光素汞溶液，再以50 μL/s由5号口吸入适量样品溶液，endprint

再通过6号口以50 μL/s吸入100 μL载液。在注射泵的驱动下，被吸入储液线圈中的载液推动试剂和样品迅速混合，形成混合区带，并充分反应，然后再反向以25 μL/s的流速将混合区带从连接有光纤的多功能流通池（Flow cell）流出，通过光纤光谱仪读取反应后溶液的荧光强度。每次测定结束后，用水以300 μL/s流速冲洗整个流路。所有实验操作均由FIAlab软件自动完成，上述程序操作分6步，见表1。

3 结果与讨论

3.1 荧光素汞荧光光谱

由通道5吸入200 μL荧光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），得到光谱图（图2），结果表明，荧光素汞最大发射波长位于521 nm。

3.2 荧光素汞浓度的选择及体积

考察荧光素汞浓度（1.0×10 Symbolm@@ 4 mol/L ， 1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 1.0×10 Symbolm@@ 6 mol/L）的影响，由于LOV为封闭的管道系统，管径很小，荧光素汞浓度过大， 会粘附在管道内，清洗使用试剂多、时间长，影响测定效率;荧光素汞浓度过低， 会影响测定灵敏度，故本实验选择荧光素汞的浓度为5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L。 溶液体积越大，混合程度越低，为了确保充分混合、反应完全，本实验选择荧光素汞溶液体积为50 μL。

3.3 载流NaOH溶液浓度及体积

根据文献 [11]，荧光素汞在碱性条件下荧光较强增加实验的灵敏度，本研究考察不同浓度的NaOH溶液（0.01， 0.05， 0.1， 0.2和0.5 mol/L）以及水作为载液对荧光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L）与1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L Na2S荧光强度的影响（图3），综合考虑，本实验选择0.1 mol/L NaOH作为载液。NaOH溶液为整个体系提供碱性环境，冲洗管路并推动反应后，溶液全部流过流通池，本实验采用100 μL的0.1 mol/L NaOH作为载液，即达到上述目的。

3.4 流通池检测流速

0.1 mol/L NaOH溶液中荧光素汞与1.0×10 Symbolm@@ 5mol/L Na2S反应后，考察通过流通池流速分别为10， 15， 20， 25， 30， 35和40 μL/s时的信号强度。结果表明，流速过慢，会加大对供试品的稀释效应;流速过快，信号稳定，重现性降低。在流速为25 μL/s时，检测信号最强且稳定（图4）。

3.5 干扰物质测定

据文献[12]报道，含巯基氨基酸可能是内源性H2S的供体，故本实验在最佳实验条件下，以5%的最大允许误差进行干扰测定，考察了L-半胱氨酸、蒜氨酸、高半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及大蒜辣素对H2S测定造成的干扰，结果如表2所示。

3.6 性能分析

荧光素汞浓度为5.0×10 Symbolm@@ 5mol/L， 0.1 mol/L NaOH溶液为载液，检测流速为25 μL/s，检测波长为521 nm，供试品进样量50 μL，测定系列浓度硫化氢肠灌流液，获得在521 nm处的荧光强度，将荧光强度与浓度进行线性回归，在5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L范围内，线性方程为y= Symbolm@@ 262.13x+26182（图5），相关系数r=0.997。

4 结 论

本实验将微量顺序注射-阀上实验室（μSIA-LOV）系统与光纤传感技术结合，建立了荧光素汞二元体系荧光猝灭法测定生物样品中H2S含量的方法。H2S作为一种信号分子，本身是内源性物质，参与和调节动物体多种生理及病理活动，目前对H2S的测定方法大多采用需取样分析，需要经过多步样品前处理。本实验则是在LOV模块上以荧光测定模式进行样品测定，简化了操作步骤，每一步操作采用程序化控制，提高了实验可重复性和规范性;整个系统微升级的进样量大大降低了试剂和样品的消耗，显著提高分析速度。本方法与光纤传感相连可实现生物体内H2S的在线监测。

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Fluorescein Mercury Combined with Optical Sensing Micro

Sequential Injection Lab-on-Valve for Determination of

H2S in Intestinal Perfusate

HOU Jun-Feng1， GUAN-Ming1， LI Xin-Xia*2

1（Laboratory on Pollution Monitoring and Control， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

2（College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract A fluorescence quenching method was established for the determination of H2S in intestinal perfusate by optical fiber sensing technology combined with micro sequential injection lab-on-valve （μSIA-lov）. In the experiment， 100 μL of 0.1 mol/L NaOH was used as the carrier， and 50 μL of 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L fluorescein mercury and 50 μL of sample were selected for the determination. The detection flow rate at the flowcell was 25 μL/s. According to H2S quenching fluorescence at 521 nm， the concentration of H2S in the sample was determined. The detected concentration range of H2S was 5.0×10 Symbolm@@ 6-8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， and the detection limit was 5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L. Detection result of H2S in intestinal perfusion was 3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L with 3.1% RSD （n=3）. This method can be used for the determination of H2S effectively in the samples， which lay the foundation for real-time online measurement of H2S in biological samples.

Keywords Fiber sensing; Hydrogen sulfide; Micro sequential injection lab-on-valve; Fluorescein mercury; Fluorescence quenching

（Received 29 May 2014; accepted 5 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.8126048）endprint