超高效液相色谱/串联质谱法同时测定水、土壤及粪便中25种抗生素

郭欣妍+王娜+郝利君+智勇+许静+王昝畅+单正军

摘 要 本研究通过超声提取-固相萃取，建立了利用超高效液相色谱/串联质谱同时分析粪便、土壤和水体中25种兽药抗生素的方法，考察了串联SAX小柱对土壤样品和粪便样品的净化效果，以及正己烷提取对粪便样品提取液脱脂的净化效果。实验结果表明：本方法对25种兽药抗生素加标回收率为50.0%～121.9%，相对标准偏差为 1.1%～14.7%（n=9）;土壤和粪便的方法检出限为0.0002～0.0560 μg/kg，水体的方法检出限为0.002～0.28 ng/L;串联SAX强阴离子交换柱后，土壤样品的基质效应降低为75%～160%之间，粪便样品降低为55%～120%之间;粪便样品经正己烷脱脂后，基质效降为55%～120%之间。已将本方法应用于养殖场周边环境介质的检测。

关键词 抗生素; 喹诺酮类; 磺胺类; 四环素类; 大环内酯类; 液相色谱-串联质谱

1 引 言

兽药抗生素除了被广泛用于预防和治疗动物疾病^[1]，还有一大部分在畜禽养殖业中以亚治疗剂量添加于动物饲料中^[2，3]，起到刺激动物生长和促进增产的作用。兽药抗生素在动物体内不能完全代谢降解，随畜禽粪便和尿液排出的比例很高^[4]，这些含兽药抗生素的畜禽粪便可通过有机肥料的施用进入农田土壤，并有可能通过渗透、径流、淋溶等方式迁移到地表水和地下水中，而水体中的兽药抗生素也有可能被沉积物吸附^[5，6]。已有不少文献报道了粪便、土壤、水体和沉积物等环境介质中检测到高浓度的兽药抗生素^[7，8]。

近年来，国内外对抗生素的研究日趋重视，关于环境中抗生素残留检测的研究很多^[7，8]。但由于环境介质成分的复杂性会对抗生素的分析带来不可预知的干扰，严重影响分析方法的准确性，开发一种能有效降低复杂环境介质的基质效应干扰，并且同时检测不同环境介质中多类抗生素残留的分析方法尤为重要。马丽丽等^[9]报道了一种土壤中同时检测磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类18 种抗生素的方法，葛峰等^[10]报道了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定有机肥中四大类18种抗生素残留的方法，但上述方法均忽略了复杂基质对检测的影响，缺少对复杂基质的净化研究。本研究通过超声提取-固相萃取，建立了25种目标抗生素的高灵敏检测方法，实现了对25种抗生素在土壤、粪便和水体介质中残留的同时分析，并且验证了SAX小柱对粪便（土壤）样品提取液的净化效果和正己烷对粪便样品提取液脱脂的净化效果，提供了能降低粪便（土壤）样品基质效应行之有效的方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪-Quattro Premier XE 质谱仪， 配 MassLynx V.4.1 软件Waters Acquity;UPLC BEH C18 色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）。以上仪器购自美国Waters公司。真空冷冻干燥机（美国Virtis公司）;高速冷冻离心机（德国Sigma公司）;Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）;AG-285电子天平（瑞士Mettler公司）;MG-2200氮吹仪（日本EYELA公司）;12通道固相萃取装置（美国Waters公司）;Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg， 6 mL， 美国Waters公司）;强阴离子SAX交换柱（200 mg， 6 mL，安谱公司）。

乙腈、甲醇，甲酸（色谱纯，德国Merck公司）;实验用水为经Milli-Q净化系统 （0.22 μm孔径过滤膜） 过滤的去离子水;磷酸盐缓冲液（pH= 3）：将27.2 g KH2PO4与1.35 mL H3PO4用去离子水定容至1 L。

标准品：诺氟沙星（Norfloxacin，99.5%），环丙沙星（Ciprofloxacin，95.0%），恩诺沙星（Enrofloxacin，98.0%），氧氟沙星（Ofloxacin，99.0%），氟罗沙星（Fleroxacin，99.0%），沙拉沙星（Sarafloxacin，99.0%），磺胺嘧啶（Sulfadiazine，98.0%），磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine， 99.0%），磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，99.0%），磺胺间二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， 98.0%），磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole，99.5%），磺胺噻唑（Sulfathiazole，99.5%），磺胺氯哒嗪（Sulfachloropyridazine，100.0%），四环素（Tetracycline，98.0%），土霉素（Oxytetracycline，95.6%），金霉素（Chlortetracycline，92.0%），强力霉素（doxycycline， 98.5%），红霉素（Erythromycin， 95.30%），罗红霉素（Roxithromycin， 98.20%），泰乐菌素（Tylosin， 91.70%），交沙霉素（Josamycin，99.0%），克林霉素（Clindamycin， 93.4%），林可霉素（Lincomycin，99.0%），万古霉素（Vancomycin，91.20%）头孢唑林钠（Cefazolin Sodium，96.5%），均购于德国Dr. Ehrenstorfer 公司。

内标：环丙沙星-d8（Ciprofloxacin-d8，98.0%），磺胺二甲嘧啶-d6 （Sulfamethazine-d6， 98.0%），四环素-d6（Tetracycline-d6，95.0%），红霉素-d4（Erythromycin-d4，99.0%）， 均购自美国多伦多研究化学品公司。endprint

上述标准品均用甲醇配制成1000 mg/L标准储备液，其中磺胺嘧啶及喹诺酮类的6种药物因在甲醇中溶解度较小，使用1% 氨水-甲醇配制， Symbolm@@ 40 ℃储存。配制上述25种抗生素的10 mg/L混合标准液。

2.2 提取和净化方法

水样：准确量取经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤的水样500 mL，加入10 μL 内标（10 mg/L的磺胺二甲嘧啶-d6、四环素-d6、环丙沙星-d8和1.0 mg/L去水红霉素-d4）以及0.4 g EDTA，并立即在4 ℃储存。在提取之前，用甲酸调节至pH 2.0～3.0。预先依次用6 mL甲醇、6 mL超纯水、6 mL磷酸盐缓冲液（pH=3）对HLB固相萃取柱淋洗活化。控制流速约为3～5 mL/min，将提取液上柱。过柱完成后，用6 mL超纯水冲洗HLB柱。抽真空30 min，以去除柱中残留水分，然后将HLB柱在N2保护下干燥10 min。最后以2 mL甲醇洗脱3次，收集洗脱液，并在室温下用N2吹至近干，用乙腈-0.2%甲酸 （1∶9，V/V）混合液定容至1mL，涡旋振荡2～3 min，18000 r/min离心10 min，取上清液待分析。

土壤样品： 土壤采自农田表层（0～20 cm）新鲜水稻土土样，剔除其中的小石块以及植物残体，将土壤样品置于 Symbolm@@ 40 ℃冷冻一周后，使用冷冻干燥仪进行干燥。研磨干燥土样，过250 μm孔径尼龙筛，置于 Symbolm@@ 40 ℃存放。准确称取10 g±0.01 g经研磨的土壤样品于50 mL离心管中，加入10 μL 内标物质，并加入0.4 g EDTA以及混合提取液30 mL（磷酸盐缓冲液（pH=3）-乙腈，1∶1，V/V），涡旋2 min，超声提取20 min，4 ℃下8000 r/min离心8min，收集上层提取液。反复提取2次后，合并提取液并混匀。用旋转蒸发仪旋蒸（220 Pa，50 ℃）提取液，直至剩余30 mL以下，用蒸馏水稀释到200 mL，用甲酸调至pH 2.8～3.0，将稀释液过0.45 μm孔径玻璃纤维微孔滤膜，以去除大颗粒杂质。土壤提取液用SAX-HLB串联固相萃取柱净化与富集，过柱完成后，去除SAX柱，其余处理过程与水样方法相同

粪便样品： 粪便样品置于 Symbolm@@ 40 ℃冷冻一周，使用冷冻干燥仪进行干燥。研磨干燥粪便样，过250 μm孔径尼龙筛，置于 Symbolm@@ 40 ℃ 存放。准确称取5 g±0.01 g经研磨的粪便样品于50 mL离心管中，加入10 μL 内标物质。提取、浓缩、稀释过程与土壤样品相同。稀释液用100 mL 正己烷萃取2次，脱去粪便中的脂肪。余下处理过程与土壤样品相同。

2.3 LC-MS/MS测定

MS检测条件：电喷雾离子源（ESI），离子源温度为120 ℃，脱溶剂温度为380 ℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速为500 L/h，锥孔气流速为50 L/h，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式（MRM）检测。ESI-MS/MS选择性反应正离子检测，进样5 μL，检测离子和各子离子碰撞能量见表1。

HPLC测定条件：柱温：35 ℃，流动相：乙腈（A）和0.2%（V/V）甲酸（B），流速0.3 mL/min;测定时采用的流动相梯度为：0～7 min，10%～40% A;7～9 min，40%～60% A;9～9.01 min，60%～10% A;

2.4 分析方法的质量控制

本实验采用全程空白、平行样和内标对分析过程进行质量控制，确保结果的可靠性。处理数据时，采用了标准添加法对各待测化合物在土壤（粪便、天然水体）基质中存在的不可忽略的基质效应进行了校正。在环境分析中，标准添加法是校正LC-ESI-MS/MS法基质效应影响的可行措施。本实验中将2.3项下处理的土壤（粪便、水样）提取液平均分成两份。其中一份直接进样分析，记录待测样品和内标的峰面积;另一份根据第一份的检出情况，精密加入各化合物标准混合工作液适量，然后进样分析，记录待测样品和内标的峰面积。依据标准添加法校正公式计算样品浓度C=SRx/（Rs-Rx），其中C为校正后的浓度;S为标准添加量;Rx为标准液添加前测得待测样品与内标峰面积比值; Rs为标准液添加后测得待测样品与内标峰面积比值。

3 结果与讨论

3.1 红霉素的降解与去水红霉素标准品的制备

空白加标和基质加标实验均发现红霉素的回收率低于10%，说明本方法不适合红霉素的检测，这与文献[11，12]报道的结果接近。同时监测红霉素和去水红霉素，可得到红霉素溶解于乙腈-0.2%甲酸溶液（1∶9，V/V）中时，会有明显的降解现象。张秀蓝等^[11]在全扫描条件下分析了酸性溶液中红霉素的降解产物，进一步证实了红霉素在酸性条件下发生分子内脱水环合生成脱水红霉素。

由于本研究测定体系中（提取-固相萃取-浓缩-定容），pH值基本维持在2～3之间，红霉素在此pH值区间以脱水红霉素的形式稳定存在。因此在测定实际环境样品过程中，需通过检测脱水红霉素来实现对红霉素的监测。去水红霉素标准品在市场中难以获取，本研究用下述方法制备去水红霉素标准品：以30%甲醇 配制100 mg/L红霉素，用3 mol/L H2SO4调节至pH 3，在室温下连续搅动3 h，以使红霉素能完全转变为去水红霉素^[13]，并用质谱监测红霉素的剩余量，以确证该反应进行完全。同理，以此法制备去水红霉素内标标准品。

3.2 样品的净化

由于在ESI模式下UPLC-MS/MS色谱系统共洗脱化合物之间存在电离竞争，基体效应（离子抑制和离子增强）是不可避免的。基质效应（ME）可表示为同一添加浓度的被分析物在基质中的信号与分析物在溶液中的信号比值，公式如下^[14]：endprint

其中， Cm和Cs表示被分析物在基质中和在溶液中的溶度。当基质效应在80%～120%之间表明基质效应可忽略，当基质效应在50%～80%和120%～150%之间则表明有轻微的不可忽略基质效应^[17]。

3.2.1 SAX强阴离子交换柱对粪便样品和土壤样品的净化

土壤腐殖质多由分解的植物和动物遗体和肥料组成，约占土壤成分1～10%，典型的菜园土的含量通常在5%以上，腐殖质一般带负电，极容易从土壤转移到提取液中，干扰目标抗生素的测定。猪粪的质地较细，成分较复杂，含蛋白质、脂肪类、有机酸、纤维素、半纤维素以及无机盐等。按照2.3节的提取方法提取样品，必然会不可避免地提取出一些影响目标抗生素离子化的成分。SAX强阴离子交换柱被放置在HLB固相萃取柱顶部，能有效地吸附土壤提取液中带负电的腐殖质分子以及去除粪便提取液中的带负电的杂质分子，降低其基质效应。图2 为串联SAX小柱对土壤样品与粪便样品的基质效应降低效果图，串联SAX强阴离子交换柱后，土壤基质和粪便基质对目标抗生素离子增强或抑制的效应明显减弱，土壤样品的基质效应由55%～180%转化为75%～160%，粪便样品的基质效应由20%～165%转化为55%～120%。

3.3.2 正己烷萃取脱脂 正己烷脱脂步骤一般用于肉类等脂肪含量高的样品的的前处理过程^[15]，干燥粪便约含有10%～15%脂肪。粪便中的脂肪溶于提取液的有机相，并在随后浓缩去除有机相的步骤中，以半固体大分子的形态转移到水相中。脂肪大分子会增加稀释液的粘稠度，在低温下还会析出，堵塞固相萃取小柱，严重影响分析过程的流畅性，脂肪大分子的存在也会增加基质对目标抗生素离子增强或抑制的效应。因此，在处理粪便样品时需要在稀释液上样前，增加正己烷萃取脱脂步骤，以降低粪便样品的基质效应。

由图3对比可知，粪便样品的基质效应25%～190%转变为55%～120%。为保证增加正己烷萃取脱脂步骤不会降低实验的回收率，以江苏农科院猪粪空白为基底，进行加标回收实验，结果如图3，正己烷萃取脱脂对喹诺酮类、四环素类、万古霉素和头孢唑林钠的回收率基本没有影响，并且能提高磺胺类和大环内酯类的回收率。

3.3 方法学确证

3.3.1 标准工作曲线与检出限 采用无检出抗生素的土壤空白、粪便空白和水体空白，按2.3节所述方法处理后，加入混合标准溶液，配制成目标抗生素浓度为0.0002～5.000 mg/L的系列基质加标标准溶液，进行UPLC-MS/MS测定。以抗生素标样的3倍信噪比（S/N=3）所对应的标样浓度计算方法检测限（表2），目标抗生素的相关系数在0.990～0.998之间。

3.3.2 方法的回收率

吸取适量混合标准工作液到土壤空白、粪便空白和水体空白，配成含25种目标抗生素浓度范围在0.1～300 μg/kg（0.002～6.0 μg/L）之间的高中低3个浓度的待测样品，每个浓度水平5份，按2.3节处理方法处理后，进行UPLC-MS/MS测定，记录各化合物及内标色谱峰面积。计算各待测化合物在空白水样的方法回收率（表2），RSD在1.1%～14.7%之间。

3.4 实际样品检测

2014年3月在南京市六合区养猪场采集的样品主要有水样、土壤、猪粪。粪便样品分别为养殖场饲养的母猪、育肥猪、仔猪排放。采集的3份水样为从猪场排出的废水，水样釆集方法是使用采水器取深度0.5 m处的水。土样采自该养殖场周边菜地0～20 cm的表层土壤，在直径50 cm左右的范围内取样约1 kg。采用本方法对粪便、土壤和水样进行分析，结果见表3。由表3可知：（1）该养猪场粪便样品中检出的抗生素主要为四环素类抗生素和大环内酯类抗生素，检出的抗生素种类较为丰富，并且育肥猪、仔猪和母猪的粪便中检出的抗生素品种不尽相同，这可能与喂养的商品化精饲料不同有关;（2）在猪场排出的废水中检出了喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类等多类抗生素。猪场排出的废水存放在室外，长期暴露在阳光中，废水中的抗生素在微生物、光照等条件作用下发生水解，因此废水中抗生素的暴露浓度均低于粪便;（3）猪场菜地检出喹诺酮类和大环内酯类抗生素。喹诺酮类和大环内酯类抗生素在土壤中降解较慢，吸附性强^[16，17]，这两类抗生素能较长时间稳定地残留在土壤基质。

References

1 WANG Na， SHAN Zheng-Jun， GE Feng， SHI Li-Li， JIAO Shao-Jun. The Administration and Technique of Environmental Monitoring， 2010， 5： 14-18

王 娜， 单正军， 葛 峰， 石利利， 焦少俊. 环境监测管理与技术， 2010，  5： 14-18

2 CEC. 1998a. Council regulation 2788/98. Official Journal of the European Communities Legislation， L347， 32

3 CEC. 1998b. Council Regulation 2821/98. Official Journal of the European Communities Legislation， L351，4

4 Aust M O， Godlinski F，Travis G R， Hao X， Hao X， McAllister T A， Leinweber P， Thiele-Bruhn S. Environmental Pollution，  2008，  156： 1243-1251endprint

5 Burkhardt M， Stamm C， Waul C，Heinz S， Stephan M. Journal of Environmental Quality，  2005，  34： 1363-1371

6 Kay P， Blackwell， P A， Boxall A B A. Chemosphere，  2005，  59： 951-959

7 Tong L， Li P， Wang Y X， Zhu K. Chemosphere，  2009，  74： 1090-1097

8 LI Yan-Xia， LI Wei， ZHANG Xue-Lian， YANG Ming. Chinese J. Anal. Chem.，  2012，  40（2）： 213-217

李艳霞， 李 帷， 张雪莲， 杨 明. 分析化学， 2012，  40（2）： 213-217

9 MA Li-Li， GUO Chang-Sheng， HU Wei， SHA Jian， ZHU Xing-Wang，RUAN Yue-Fei， WANG Yu-Qiu. Chinese J. Anal. Chem.，  2010，  38（1）： 21-26

马丽丽， 郭昌胜， 胡 伟， 沙 健， 朱兴旺， 阮悦斐， 王玉秋.  分析化学， 2010，  38（1）： 21-26

10 GE Feng， GUO Kun， TAN Li-Chao， DAI Yi-Jun. Journal of Ecology and Rural Environment，  2012，  28（5）： 587-594

葛 峰， 郭 坤， 谭丽超， 戴亦军.  生态与农村环境学报， 2012，  28（5）： 587-594

11 ZHANG Xiu-Lan， ZHANG Ting， DONG Liang， SHI Shuang-Xin， YANG Wen-Long， ZHANG Li-Fei， ZHOU Li， HUANG Ye-Ru. Journal of Instrumental Analysis，  2013，  31（4）： 453-458

张秀蓝， 张 烃， 董 亮， 史双昕， 杨文龙， 张利飞， 周 丽， 黄业茹.  分析测试学报， 2013，  31（4）： 453-458

12 Christa S M， Eva M，Marc J F S， Walter G. Environmental Science & Technology，  2003，  37（24）： 5479-5480

13 Grujic′ S， Vasiljevic′ T，  Laǔsevic′ M， J. Chromatogr. A，  2009，  1216（25）： 4989-5000

14 Huang Y J， Cheng M M， Li W H， Wu L H， Chen Y S， Luo Y M， Peter C D， Zhang H B. Anal. Methods，  2013，  5： 3721-3731

15 LI Gui-Zhi， GAO Fu-Kai， ZHANG Xing-Mei， LIU Yong-Ming. Chinese J. Anal. Chem.，  2013，  41（10）： 1592-1596

李桂芝， 高福凯， 张兴梅， 刘永明.  分析化学， 2013，  41（10）： 1592-1596

16 Boxall A B， Blackwell P， Cavallo R， Kay P， Tolls J. Toxicol Lett，  2002，  131： 19-28

17 Tolls J. Environ. Sci. Technol.，  2001，  35： 3397-3406

Simultaneous Detection of 25 Kinds of Veterinary Antibiotics in Soil，

Manure and Water Samples Using Liquid Chromatography-

Tandem Mass Spectrometry

GUO Xin-Yan1， WANG Na*1， HAO Li-Jun2， ZHI Yong3， XU Jing1， WANG Zan-Chang1， SHAN Zheng-Jun1

1（Nanjing Institute of Environmental Science， Ministry of Environmental Protection， Nanjing 210042， China）

2（Faculty of Science Analytical Chemistry Department， China Pharmaceutical University Nanjing 211198， China）

3（Nanjing University of Information Science and Technology， Nanjing 210044， China）endprint

Abstract A liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was established for the determination of 25 kinds of veterinary antibiotics in manure， soil and water by ultrasonic-solid phase extraction. Purification efficiency of SAX cartridges for soil and manure samples extract and the procedure that manure samples defatted with hexane was also verified. The results showed that the average recoveries of the 25 target antibiotics were 50.0%-121.9%， the relative standard deviations （RSD） were 1.1%-14.71% （n=9）， and the limits of detection （LOD） ranged from 0.0002-0.0560 μg/kg for soil and manure and ranged from 0.002-0.28 ng/L for water; After adding SAX cartridges， the matrix effects of manure samples reduced to 55%-120%， and soil samples to 75%-160%; after defatting by hexane extraction， the matrix effects of manure sample reduced to 55%-120%. This method has been employed to detect the veterinary antibiotics in environmental samples of livestock farm.

Keywords Antibiotics; Quinolones; Sulfonamides; Tetracyclines; Macrolides; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（Received 27 June 2014; accepted 16 September 2014）

This work was supported by the Commonweal and Environmental Protection Project for the MEP Grant （Nos.201109038， 201309031）endprint