微波—超声波联合提取青钱柳总黄酮和总三萜提取工艺

黄元河　潘乔丹　唐海燕　等

摘要：研究青钱柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja]总黄酮和总三萜的微波-超声波联合提取工艺，试验采用单因素试验和正交试验优化青钱柳中总黄酮和总三萜的最佳提取工艺。结果表明，青钱柳总黄酮的最佳条件为70%乙醇，液料比（m/V，g：mL）为1∶30，微波800 W-超声波1 000 W联合处理4 min；总三萜提取的最佳条件为80%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波800 W联合处理4 min，在此条件下微波-超声波联合提取青钱柳总黄酮和总三萜平均提取率分别为4.379%和2.998%。

关键词：青钱柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja]；总黄酮；总三萜；微波-超声波联合

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5515-03

青钱柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja]又名青钱李、山麻柳、一串钱、甜茶树、摇钱树等，为胡桃科植物，是国家重点保护的濒危植物之一，属三类保护植物。民间常取其叶片制作茶饮料，有清热解暑，降压降糖等功效。青钱柳主要成分有三萜皂苷、黄酮、甾体、有机酸等，具有降血糖、降血脂、降血压、增强免疫力、抗氧化防衰老等药理活性[1]。其中黄酮类可能具有多种保健功能，而三萜类具有降糖、降压、降血脂的等功能活性[2-4]。虽有微波或超声波青钱柳总黄酮或总三萜提取工艺的报道[4，5]，但有关微波-超声波联合提取总黄酮和总三萜的报道较少见。微波-超声波联合提取具有用时短、既简便又快速的特点，综合了微波和超声波的优点，因此本研究以青钱柳为原料，总黄酮和总三萜含量为指标，通过单因素试验和正交试验优选青钱柳总黄酮和总三萜的微波-超声波联合提取工艺，旨在为青钱柳产业的进一步开发和综合利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青钱柳枝叶采于广西隆林，干燥粉碎后备用；芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100080-200707；齐墩果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号为110709-200505；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器

DF-15型台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司），TU-1800型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），XH-300A型微波超声波组合合成萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），FA1104型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司），KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取 称取青钱柳粉末0.5 g，分别按照单因素试验和正交试验设计的条件进行提取，浓缩蒸干后得到提取浸膏，再用70%乙醇定容至25 mL，即得供试溶液。含量测定前，采用试管预试法[6]和薄层硅胶法检验，结果都显阳性，表明青钱柳中含有黄酮类和三萜类化合物。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制 以芦丁为标准品，配制不同浓度梯度，采用三氯化铝显色法[7]，运用分光光度计于409 nm处测吸光度，以吸光度（A）与浓度（C）进行直线回归，得回归方程为A1=22.833C1 +0.006，r=0.999 8。

1.3.3 齐墩果酸标准曲线的绘制 以齐墩果酸标准品配制不同浓度梯度，采用香草醛-高氯酸显色法[8]，运用分光光度计于549 nm处测吸光度，以吸光度（A）与浓度（C）进行直线回归，得回归方程为A2=71.264C2 -0.021 3，r=0.999 8。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对提取率的影响 固定微波功率700 W，料液比（m/V，g∶mL，下同）1∶25，时间10 min，超声波功率800 W，考察乙醇体积分数在50%～90%范围内对提取效果的影响，结果见图1。从图1可知，乙醇体积分数为70%左右时总黄酮和总三萜的提取率最高，因此选择60%～80%的体积分数范围进行正交试验。

2.1.2 料液比对提取率的影响 固定乙醇体积分数70%，微波功率700 W，超声波功率800 W，时间10 min的条件下考察料液比对提取效果的影响，结果见图2。从图2可知，总黄酮和总三萜在料液比为1∶25之后吸光度变化不大，因此选择料液比为1∶（20～30）的范围进行正交试验。

2.1.3 微波功率对提取率的影响 固定乙醇体积分数70%，料液比1∶25，超声波功率800 W，时间10 min的条件下考察微波功率在200～800 W范围内对提取效果的影响，结果见图3。从图3可知，总黄酮和总三萜在微波功率为700 W左右提取率最高，因此选择600～800 W的范围进行正交试验。

2.1.4 提取时间对提取率的影响 考察提取时间在4～20 min范围内对提取效果的影响，结果见图4。从图4可知，总黄酮和总三萜在提取时间为4 min时已达到一定值之后吸光度变化不大，因此正交试验时固定提取时间为4 min。

2.1.5 超声波功率对提取率的影响 固定乙醇体积分数70%，料液比1∶25，微波功率700 W，时间4 min的条件下考察超声波功率在400～1 200 W范围内对提取效果的影响，结果见图5。从图5可知，总黄酮在微波功率为800 W左右提取率最高，而总三萜1 000 W左右提取率最高，因此选择600～1000 W的功率范围进行正交试验。

2.2 正交设计优化提取工艺

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液比、微波功率、超声波功率等作为考察因素，选用L9（34）正交表安排试验。正交试验设计及结果分析见表1。由极差分析表明，4个因素影响总黄酮提取率的顺序依次为A、C、B、D，影响总三萜提取率的顺序依次为B、C、D、A。总黄酮的最佳提取条件为A2B3C3D3，即70%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W、超声波1 000 W联合处理4 min；总三萜的最佳提取条件为A3B3C3D2，即80%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波800 W联合处理4 min。取青钱柳5份，每份0.5 g，均在最佳提取条件下进行验证，实际测得青钱柳中总黄酮和总三萜的平均提取率分别为4.379%和2.998%。

2.3 精密度试验

精密吸取青钱柳同一供试品溶液6份，按照总黄酮和总三萜的最佳提取方法测提取率，RSD分别为1.0%、1.1%（n=6），说明精密度良好。

2.4 重复性试验

取青钱柳粉末各5份，按供试品溶液制备方法制备青钱柳供试品溶液，进行总黄酮和总三萜测定，RSD分别为0.98%、1.3%（n=5）。

2.5 稳定性试验

精密吸取一定量青钱柳供试品，按标准曲线制备项方法操作，显色后60 min内，每隔10 min测定1次吸光度，总黄酮和总三萜的提取率的RSD分别为1.1%、1.3%（n=7），表明显色后的溶液在60 min内稳定。

2.6 加标回收试验

分别向已知质量分数的样品提取液中加入一定量的芦丁标准品溶液和齐墩果酸标准溶液进行试验，结果显示平均加标回收率分别为100.17%、99.31%，RSD分别为1.2%、0.84%（n=5），表明该法回收率良好。

3 结论

微波-超声波是目前采用的较为先进的药用植物提取方法，其综合克服了常规超声波和微波萃取之不足，具有速度快、耗能小、溶剂用量小、回收率高等优点[9]。本试验应用微波-超声波联用技术，采用单因素试验和正交试验优化青钱柳中总黄酮和总三萜的最佳提取工艺。青钱柳总黄酮的最佳条件为70%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波1 000 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总黄酮提取率为4.379%，高于文献[10，11]报道的提取率；青钱柳总三萜的最佳提取条件为80%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波800 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总三萜提取率为2.998%。因此，采用微波-超声波联用技术，总黄酮和总三萜提取率较高，且试验用时较少，既经济又省时，值得推广。

参考文献：

[1] 王克全，曹 莹.青钱柳化学成分及药理作用的研究进展[J].黑龙江医学，2007，31（8）：577-579.

[2] 舒任庚.青钱柳植物化学成分研究简报[J].江西中医学院学报，1996，8（2）：34.

[3] 易 醒，谢明勇.青钱柳对胆固醇调节作用的初步研究[J].中国商办业，2000（4）：51.

[4] 杨武英，上官新晨，徐明生，等.微波辅助法提取青钱柳叶总黄酮工艺研究[J].江西农业大学学报，2007，29（6）：1016-1020.

[5] 尹忠平，上官新晨，黎冬明，等.超声辅助提取青钱柳叶总三萜化合物研究[J].江西农业大学学报，2010，32（2）：373-377.

[6] 北京医学院.中草药成分化学[M].北京：人民卫生出版社，1988.

[7] 李富民，谭 杰，聂少平，等.青钱柳总黄酮测定方法研究[J].江西食品工业，2006（4）：34-37.

[8] 蔡亚玲，阮金兰，苏 群，等.紫背鼠尾草中总三萜酸的含量测定[J].中药材，2008，31（5）：692-693.

[9] 杨胜丹，付大友.超声波微波萃取及其联用技术在中药有效成分提取中的应用[J].广东化工，2010，37（2）：120-122，130.

[10] 谢明勇，王远兴，温辉粱，等.青钱柳中黄酮甙和维生素含量的测定[J].食品科学，2001，22（1）：66-68.

[11] 朱贲峰，贺肇东，王政峰，等.不同产地青钱柳的总黄酮含量比较[J].海峡药学，2004，16（3）：88-89.

（责任编辑 龙小玲）

2.3 精密度试验

精密吸取青钱柳同一供试品溶液6份，按照总黄酮和总三萜的最佳提取方法测提取率，RSD分别为1.0%、1.1%（n=6），说明精密度良好。

2.4 重复性试验

取青钱柳粉末各5份，按供试品溶液制备方法制备青钱柳供试品溶液，进行总黄酮和总三萜测定，RSD分别为0.98%、1.3%（n=5）。

2.5 稳定性试验

精密吸取一定量青钱柳供试品，按标准曲线制备项方法操作，显色后60 min内，每隔10 min测定1次吸光度，总黄酮和总三萜的提取率的RSD分别为1.1%、1.3%（n=7），表明显色后的溶液在60 min内稳定。

2.6 加标回收试验

分别向已知质量分数的样品提取液中加入一定量的芦丁标准品溶液和齐墩果酸标准溶液进行试验，结果显示平均加标回收率分别为100.17%、99.31%，RSD分别为1.2%、0.84%（n=5），表明该法回收率良好。

3 结论

微波-超声波是目前采用的较为先进的药用植物提取方法，其综合克服了常规超声波和微波萃取之不足，具有速度快、耗能小、溶剂用量小、回收率高等优点[9]。本试验应用微波-超声波联用技术，采用单因素试验和正交试验优化青钱柳中总黄酮和总三萜的最佳提取工艺。青钱柳总黄酮的最佳条件为70%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波1 000 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总黄酮提取率为4.379%，高于文献[10，11]报道的提取率；青钱柳总三萜的最佳提取条件为80%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波800 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总三萜提取率为2.998%。因此，采用微波-超声波联用技术，总黄酮和总三萜提取率较高，且试验用时较少，既经济又省时，值得推广。

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（责任编辑 龙小玲）

2.3 精密度试验

精密吸取青钱柳同一供试品溶液6份，按照总黄酮和总三萜的最佳提取方法测提取率，RSD分别为1.0%、1.1%（n=6），说明精密度良好。

2.4 重复性试验

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2.5 稳定性试验

精密吸取一定量青钱柳供试品，按标准曲线制备项方法操作，显色后60 min内，每隔10 min测定1次吸光度，总黄酮和总三萜的提取率的RSD分别为1.1%、1.3%（n=7），表明显色后的溶液在60 min内稳定。

2.6 加标回收试验

分别向已知质量分数的样品提取液中加入一定量的芦丁标准品溶液和齐墩果酸标准溶液进行试验，结果显示平均加标回收率分别为100.17%、99.31%，RSD分别为1.2%、0.84%（n=5），表明该法回收率良好。

3 结论

微波-超声波是目前采用的较为先进的药用植物提取方法，其综合克服了常规超声波和微波萃取之不足，具有速度快、耗能小、溶剂用量小、回收率高等优点[9]。本试验应用微波-超声波联用技术，采用单因素试验和正交试验优化青钱柳中总黄酮和总三萜的最佳提取工艺。青钱柳总黄酮的最佳条件为70%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波1 000 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总黄酮提取率为4.379%，高于文献[10，11]报道的提取率；青钱柳总三萜的最佳提取条件为80%乙醇，液料比为1∶30，微波800 W-超声波800 W联合处理4 min，在此条件下青钱柳总三萜提取率为2.998%。因此，采用微波-超声波联用技术，总黄酮和总三萜提取率较高，且试验用时较少，既经济又省时，值得推广。

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[10] 谢明勇，王远兴，温辉粱，等.青钱柳中黄酮甙和维生素含量的测定[J].食品科学，2001，22（1）：66-68.

[11] 朱贲峰，贺肇东，王政峰，等.不同产地青钱柳的总黄酮含量比较[J].海峡药学，2004，16（3）：88-89.

（责任编辑 龙小玲）