高效液相色谱法测定艾附暖宫丸中芍药苷和阿魏酸的含量

李洪亮 乔 静，2▲

1.湖北医药学院附属人民医院中药药理实验室，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院药学院，湖北十堰 442000

艾附暖宫丸是市售非处方妇科用药，该药被《中国药典》2015 年版一部收载， 处方被 《仁斋直指附遗》、《回春》、《女科切要》、《古今医鉴》 等多部古医书记载，由艾叶（炭）、醋香附、制吴茱萸、肉桂、当归、川芎、白芍（酒炒）、地黄、炙黄芪和续断等组成。 具有理气补血、调经止痛、温暖子宫的功效。 用于血虚气滞、下焦虚寒所致的月经不调、痛经等症[1]，是治疗因寒凝而致的月经不调、小腹疼痛、经血量少、久无子息等病症的代表方剂[2]。芍药苷、阿魏酸是白芍、当归、川芎的主要有效成分。 目前市售艾附暖宫丸的规格较多，相关质量控制研究文献报道较少[2-5]，丁华[6]调查了市售36 批艾附暖宫丸，结果显示合格率只有97%，并得出结论，其质量标准还需进一步完善和提高。 艾附暖宫丸处方组成复杂，《中国药典》2015 年版一部该药项下规定检测本品芍药苷的含量，专属性较差，难以评价全面质量。目前，高效液相色谱已经普及，同时测定两种或以上成分的方法已广泛应用于中药饮片、提取物及制剂质量控制[7-9]。处方中当归、川芎、白芍均为君药，基于此，本实验使用高效液相色谱法同时快速测定本品中芍药苷、阿魏酸含量，能够更好地控制制剂的质量。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-20A 高效液相色谱仪 （LC-20AD泵，SPD-M20A 检测器，SIL-20A 自动进样器，吉尔森TC-100 柱温箱，LCsolution 色谱工作站）；FA-2004 电子分析天平（上海天平仪器厂）；KQ3200 超声波清洗仪（江苏昆山超声波仪器厂）；艾附暖宫丸（天津天士力公司，9 g×14 袋/盒，批号：20140318；北京同仁堂股份有限公司同仁堂制 药厂，6 g×10 袋/盒， 批 号：1035034；山西华康药业股份有限公司，9 g×10 丸/盒，批号：20110501；内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，4 g×6 袋/盒，批号：20130632）；芍药苷对照品、阿魏酸对照品均来自中国食品药品检定研究院 （批号分别为：120903-200809，0773-9910）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥恒重的芍药苷、阿魏酸对照品适量，加50%乙醇稀释成每毫升溶液中芍药苷430 μg、阿魏酸489.6 μg 的储备液备用。2.1.2 供试品溶液的制备 取艾附暖宫丸， 小丸碾碎，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 50%乙醇，精密称定重量，超声处理40 min，放冷，补足重量， 转移至20 mL 玻璃离心管中，3000 r/min 离心5 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按处方工艺制备不含白芍、当归和川芎的阴性样品，按“2.1.2”项下条件制备，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Sinochrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30℃，流动相：乙腈：0.03 mol/L 醋酸铵（含0.25%甲酸）（13∶87），流速：0.9 mL/min，检测波长为230～321 nm，进样量：10 μL。在此色谱条件下芍药苷、阿魏酸同杂质峰的分离度大于1.5， 且阴性样品溶液在相应保留时间无干扰。 结果见图1。

2.3 测定方法

精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以回归方程计算样品中芍药苷、阿魏酸的含量。

2.4 线性关系考察

图1 标准品溶液（A）、样品溶液（B）、阴性样品溶液（C）的HPLC 色谱图

取芍药苷标准储备液适量，用50%甲醇溶液稀释成5.2、10.4、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的溶液，10 μL 注入色谱仪，以浓度为纵坐标（Y），峰面积为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y=2.388 173×10-5X-8.639 89，r=0.998 32，表明芍药苷在5.2～41.6 μg/mL 浓度范围内线性关系良好； 另取阿魏酸标准储备液适量，用50%甲醇溶液稀释成0.489、0.979、1.958、2.937、3.916 μg/mL 的溶液，10 μL 注入色谱仪，以浓度为纵坐标（Y），峰面积为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y=2.79 451×10-7X-6.070 66×10-2（r=0.999 716）；表明阿魏酸在0.489～3.916 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

分别精密吸取芍药苷、阿魏酸对照品溶液各10 μL，连续进样5 次，测定芍药苷、阿魏酸峰面积积分值，结果芍药苷的RSD 为1.32%， 阿魏酸峰面积的RSD 为0.38%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取“2.3”项下制备的样品溶液（山西华康药业股份有限公司，9 g×10 丸/盒，批号：20110501）5 份，进样10 μL，以回归方程计芍药苷、阿魏酸的含量，平均含量分别为22.37、2.38 μg/mL，RSD 分别为1.23%和0.98%，表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一批样品的供试品溶液分别在1、2、4、6、12、24 h 进样，供试品溶液在24 h 内基本稳定，6 次测定芍药苷、阿魏酸面积的RSD 分别为0.85%、1.23%，表明该溶液在24 h 内基本稳定。

2.8 回收率试验

精密称取同一批号（天津天士力，9 g×14 袋/盒，批号：20140318）的艾附暖宫丸0.2 g，分别加入芍药苷、阿魏酸对照品储备液适量， 使溶液中加入芍药苷的含量为5、10、20 μg/mL；阿魏酸的含量为1.0、1.5、2.0 μg/mL。 按“2.1.2”项下方法处理，进样10 μL，计算加样回收率，结果见表1～2。

表1 芍药苷加样回收率实验结果（n ＝9）

表2 阿魏酸加样回收率实验结果（n ＝9）

2.9 样品含量测定

对4 批艾附暖宫丸进行含量测定以回归方程计算含量，结果见表3。

表3 样品含量测定（n = 3）

3 讨论

《中国药典》2010 年版记载艾附暖宫丸功效为理气养血，暖宫调经。《黄帝内经·素问·举痛论》指出“通则不痛，痛则不通”，其是用于气滞、寒凝、湿热淤阻所致子宫血气运行不畅[10]。 艾附暖宫丸以理气补血、温经散寒、暖宫活血为主[11]，组方中黄芪、当归、生地黄、白芍、川芎具有益气养血、补虚止痛作用[12]，现代药理学研究证实，当归、 川芎均含有的阿魏酸、挥发油等成分具有改善微循环、松弛平滑肌、抗菌消炎等作用[13-14]。白芍主要有效成分是白芍总苷，具有调节自身免疫反应等多种药理作用[15]。 处方中当归、川芎、白芍均为君药，故其有效成分可作为质量标准的主要考察指标。

由于样品来自不同厂家， 受到中药材原料产地、采收季节、加工等因素影响[16-19]，造成样品被测成分含量出现大差异。川芎、当归中均含有阿魏酸，因此在本法中测定的阿魏酸含量为川芎、 当归两者的总含量。芍药苷、阿魏酸的含量结果与文献报道基本一致[3]。

《中国药典》2015 年版规定艾附暖宫丸小蜜丸中白芍苷含量不得于0.45 mg/g， 由表3 可见检测样品中芍药苷平均含量均符合规定，阿魏酸含量与文献报道一致，平均含量在0.60～0.90 mg/g，暂可定其含量为最低不得少于0.60 mg/g。

参阅文献[1-3]，测试体积分数分别为25%、50%、75%、100%甲醇溶液，超声40 min，以50%甲醇提取的阿魏酸、芍药苷含量较高，因此采用50%甲醇超声30 min。 由于通过DAD 检测器扫描显示芍药苷最大吸收在230 nm、阿魏酸检测波长为321 nm，两者吸收波长存在较大差异， 因此采用了DAD 全波长扫描，将波长定位230～321 nm 区间，本实验方法简便、准确，灵敏度高，重现性好，可考虑作为艾附暖宫丸检测方法。

[1] 国家药典委员会.中国药典2010 年版[S].一部.北京：化学工业出版社，2010，625.

[2] 陈银海，HPLC 法快速测定艾附暖宫丸中芍药苷的含量[J].海峡药学，2014，26（12）：55-57.

[3] 季宁平，徐晓秋，傅超美，等.HPLC 法同时测定艾附暖宫丸中芍药苷、阿魏酸和川续断皂苷Ⅵ[J].中成药，2015，37（3）：534-537.

[4] 祁秀玲，王晓琦，孙会昌，等.艾附暖宫胶囊中吴茱萸次碱含量测定的研究[J].中国现代应用药学，2012，29（7）：647-649.

[5] 张雷，李琴韵，胡蓓莉，等.HPLC 测定艾附暖宫丸中吴茱萸次碱含量[J].中成药，2006，28（8）：1239-1240.

[6] 丁华.中成药艾附暖宫丸质量评价性分析[J].内蒙古中医药，2014，33（2）：38.

[7] 李洪亮，王珊珊，刘明，等.高效液相色谱法测定百咳静颗粒（儿童型）中黄芩苷的含量[J].广东药学院学报，2011，27（3）：277-279.

[8] 詹志斌，邓可众，熊英，等.高效液相色谱法同时测定枳实中6 种成分的含量[J].中国医院药学杂志，2015，35（12）：1080-1082.

[9] 汤瑶，李佐刚，王秀文，等.超高效液相色谱法同时测定丹参酮提取物中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A [J].药物分析，34（5）：813-817.

[10] 张玉珍.中医妇科学[M].北京：中国中医药出版社，2009：131-134.

[11] 王秀玲.艾附暖宫丸加味治疗寒凝气滞血瘀型痛经29例疗效观察[J].甘肃中医学院学报，2015，32（3）：38-39.

[12] 王霞灵.艾附暖宫汤为主治疗痛经的临床研究[J].中医药学刊，2003，21（5）：668.

[13] 李曦，张丽宏，王晓晓，等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材，2013，36（6）：1023-1028.

[14] 张翠英，章洪，戚琼华.川芎的有效成分及药理研究进展[J].辽宁中医杂志，2014，41（10）：2264-2266.

[15] 张利.白芍的药理作用及现代研究进展[J].中医临床研究，2014，6（29）：25-26.

[16] 牛晓军.浅析当前中药加工炮制中存在的问题[J].北方药学，2014，11（3）：115-116.

[17] 刘金亮，范巧佳，郑顺林，等.HPLC 测定不同采收期川芎药材中5 种药效成分的含量[J].中国中药杂志，2014，39（9）：1650-1655

[18] 金传山，蔡一杰，吴德玲.不同采收期亳白芍中芍药苷与白芍总苷的含量变化[J].中药材，2010，33（10）：1548-1550.

[19] 钱怡云.采收加工贮藏方法对当归药材质量的影响及其定量分析模式研究[D].兰州：甘肃中医学院，2014：1-8.