肝硬化大鼠肝缺血-再灌注损伤后Bsep、Mrp2表达在胆汁淤积中的作用研究

舒明 王火平 胡笑蓉 黄左安 黄丹丹 王咖 张顺

肝硬化大鼠肝缺血-再灌注损伤后Bsep、Mrp2表达在胆汁淤积中的作用研究

舒明 王火平 胡笑蓉 黄左安 黄丹丹 王咖 张顺

目的研究肝硬化大鼠肝缺血-再灌注损伤（HIRI）后胆汁淤积的部分分子机制。方法将健康SD大鼠随机分成A、B、C 3组，每组15只，建立肝硬化、HIRI模型。A组为正常大鼠HIRI组，B组为肝硬化大鼠假手术组，C组为肝硬化大鼠HIRI组。每组大鼠肝门阻断时间为30min。分别检测各组大鼠术后第1、3、5天的胆汁DBil、TBil含量，血清AST、ALT、TBil、DBil含量；Western blot分析各组大鼠术后第1、3、5天胆盐输出泵（Bsep）、多耐药相关蛋白2（Mrp2）表达变化；免疫组织化学法分析Bsep蛋白的细胞亚定位。结果术后第1天，C组大鼠胆汁TBil、DBil含量均低于A组（均P＜0．05）；术后第3天，C组大鼠胆汁TBil、DBil含量均低于A组和B组（均P＜0．05）；术后第5天，3组大鼠胆汁TBil、DBil含量比较差异均无统计学意义（均P＞0．05）。C组大鼠术后第1、3天血清AST、ALT水平均高于A组，术后第1、3、5天血清TBil、DBil含量均高于A、B组（均P＜0．05）。术后第1、3、5天，C组大鼠Bsep蛋白表达量均低于A组，术后第3、5天均低于B组（均P＜0．05）；C组Mrp2表达均低于A、B组（均P＜0．05）。肝细胞Bsep蛋白明显向细胞质移位。结论与正常肝脏相比，硬化肝对缺血耐受能力差，HIRI后硬化肝的胆汁淤积情况更加严重。Bsep、Mrp2表达降低以及Bsep蛋白由细胞膜向细胞质移位的改变在硬化肝HIRI后胆汁淤积中起了重要作用。

肝缺血-再灌注损伤 肝硬化 胆汁淤积

随着人们生活方式改变及环境污染加剧，肝癌和肝内胆管结石的发病率呈上升趋势。这些患者多伴有肝硬化，肝叶切除是其有效的外科治疗手段。术中为控制肝断面的出血，常采用Pringle法阻断全肝血流（肝门阻断），肝缺血-再灌注损伤（HIRI）不可避免[1]。动物和临床实验研究均证实HIRI后常伴有胆汁分泌减少、胆汁淤积的发生[2]。硬化肝脏对HIRI敏感、耐受力差，加上后继的肝叶切除可使残肝功能失代偿，术后胆汁淤积较正常肝脏严重，部分患者可出现急性肝功能衰竭甚至死亡。本研究采用肝硬化大鼠肝门阻断肝叶切除模型模仿临床肝硬化患者肝门阻断肝叶切除术后胆汁淤积的病理生理过程，通过对胆盐输出泵（Bsep）和多耐药相关蛋白2（Mrp2）的表达、定位的分析揭示胆汁淤积的发生机制，为临床肝硬化患者肝门阻断肝叶切除术后胆汁淤积的防治提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠45只，体重（220±20）g，由浙江省实验动物中心提供。

1.2 试剂和仪器 硫代乙酰胺（TAA，美国Sigma公司），AST、ALT、TBil、DBil生化指标试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗鼠Bsep一抗、兔抗鼠Mrp2一抗（英国Abcam公司），β-actin（美国Santa Cruz公司），HRP标记二抗（美国Jackson公司），PVDF膜（美国Millipore公司），SDS蛋白裂解液、ECL发光试剂盒等（上海碧云天生物技术有限公司），免疫组织化学试剂盒及DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。COBAS INTEGAR 800全自动生化分析仪（瑞典Roche公司），电泳装置（美国Bio-Rad公司），低温冰箱（日本SANYO公司），离心机（德国Eppendoff公司），石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.3 动物模型制备 大鼠按随机数字表法分为A、B、C 3组，每组15只。参照Li等[3]的方法制作肝硬化大鼠模型，建模成功后参照文献[4]的方法建立HIRI模型。其中A组为正常大鼠HIRI组，B组为肝硬化大鼠假手术组，C组为肝硬化大鼠HIRI组。研究时间点为肝缺血30min再灌注后的第1、3、5天。

1.4 胆汁与血清收集 分别于术后第1、3、5天参照文献[4]的方法收集各组大鼠胆汁，-20℃保存；采集各组大鼠下腔静脉血4ml，4℃，3 000r/min离心3min后取上清液，-20℃保存。

1.5 胆汁TBil、DBil与血清TBil、DBil、AST、ALT含量测定 按试剂说明书操作。

1.6 Western blot分析Bsep、Mrp2表达 按SDS蛋白裂解液说明书提取肝组织总蛋白，电泳上样量为50μg，5%脱脂奶粉常温封闭1h，兔抗鼠Bsep一抗、兔抗鼠Mrp2一抗、β-actin稀释浓度分别为1∶500、1∶600、1∶800，二抗浓度为1∶5 000。

1.7 免疫组织化学分析Bsep的细胞亚定位 将石蜡块切成4μm厚的切片，脱蜡水化后用0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液修复，3%H2O2灭活内源性过氧化氢酶，5% BSA封闭20min，兔抗鼠Bsep一抗浓度1∶200稀释后4℃孵育过夜，PBS洗涤后孵育山羊抗兔IgG/HRP聚合物，37℃孵育30min，PBS洗涤后DAB显色，苏木素复染，脱水透明后拍照分析。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用方差分析，两组比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 3组大鼠术后胆汁TBil、DBil水平比较 见表1。

表1 3组大鼠术后胆汁TBil、DBil水平比较（μmol/L）

由表1可见，与A组相比，C组术后第1、3天胆汁TBil、DBil水平偏低。与B组相比，C组术后第1天胆汁中TBil、DBil水平无统计学差异，但在术后第3天，C组胆汁TBil、DBil水平低于B组。术后第5天，3组大鼠胆汁TBil、DBil水平比较无统计学差异。

2.2 3组大鼠术后血清AST、ALT、TBil、DBil水平比较 见表2、3。

由表2、3可见，与A组相比，C组术后第1、3天血清ALT、AST、TBil、DBil水平均明显增高，在术后第5天两组AST水平比较差异无统计学意义，但是其他指标仍明显增高。与B组相比，C组在术后第1、3、5天血清TBil、DBil水平均明显增高。

表2 3组大鼠术后血清ALT、AST水平比较（U/L）

表3 3组大鼠术后血清TBil、DBil水平比较（μmol/L）

2.3 3组大鼠术后Bsep、Mrp2蛋白表达水平比较 见图1、表4。

图1 3组大鼠术后Bsep、Mrp2蛋白表达水平比较电泳图

表4 3组大鼠术后Bsep、Mrp2蛋白表达水平比较

由图1、表4可见，Western blot结果显示术后第1、3、5天，C组大鼠Bsep蛋白表达水平均明显低于A组，在术后第3、5天C组大鼠Bsep蛋白表达水平明显低于B组。术后第1、3、5天，C组大鼠Mrp2蛋白表达量变化不明显，但均低于A、B组，而A组呈先下降后上升的趋势。

2.4 3组大鼠术后肝细胞Bsep蛋白的细胞亚定位变化比较 见图2。

由图2可见，与A、B组相比，C组Bsep蛋白明显向细胞质移位；而A组和B组虽然存在Bsep蛋白向细胞质移位现象，但是在细胞膜上仍存有Bsep蛋白，并在术后第5天细胞膜上Bsep蛋白表达有所恢复。

3 讨论

胆汁的形成和分泌是一个复杂的过程，由肝细胞和胆管上皮细胞共同完成，正常情况下肝细胞分泌75%，胆管上皮细胞分泌25%[5]。与肝细胞相比，胆管上皮细胞对常温缺血并不敏感，大鼠肝脏常温缺血2h再灌注后足以使肝细胞的形态结构发生明显的破坏，而胆管上皮细胞间的紧密连接和活性仍能维持，很少有胆管上皮细胞的坏死或凋亡[6]。这提示在常温HIRI后胆汁淤积的发生过程中，肝细胞的损伤起了主要作用。肝细胞结构、功能的完整至关重要，如发生破坏会导致胆汁分泌障碍、胆汁不能正常流入毛细胆管内形成胆流。Bsep和Mrp2是肝细胞胆管膜侧重要的胆汁成分转运体[7]，Bsep参与的胆盐排泌是肝脏胆汁形成的主要过程和限速步骤。

有研究表明鼠HIRI后Bsep表达的下调导致了毛细胆管膜胆盐的排泌障碍[8]。本研究结果显示Bsep蛋白在HIRI后表达量出现先减后增的趋势，术后第5天其表达量逐渐恢复，而硬化肝HIRI后Bsep表达量下降，并且恢复过程缓慢。Bsep蛋白只有表达在细胞膜上才能发挥作用[9-10]，从免疫组化的结果看术后第1、3天都存在Bsep蛋白向细胞质移位的现象，术后第5天，A、B组大鼠肝脏的Bsep蛋白在细胞膜上均有所恢复，而C组大鼠肝细胞膜上的Bsep蛋白依然处于丢失状态。这与硬化肝HIRI后胆汁淤积及肝损伤都比正常肝脏严重的情况相符[11-12]。

C组Mrp2表达量与A组比较显著下调，分析原因可能是由于正常肝脏耐受力较硬化肝强，在硬化肝所能耐受的极限缺血时间里对正常肝脏的损伤有限，不足以明显影响Mrp2表达。Mrp2表达下调也可能是造成硬化肝HIRI后胆汁淤积的一个重要原因。

综上所述，与正常肝脏相比，硬化肝对缺血更加敏感，耐受能力不如正常肝脏，HIRI后硬化肝的胆汁淤积情况更加严重。肝硬化大鼠HIRI后Bsep、Mrp2表达减少以及Bsep蛋白由细胞膜向细胞质移位在胆汁淤积中起了主要作用。

[1] Jaeschke H．Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003,284(1):15-26．

[2] Accatino L,Pizarro M,Solis N,et al．Bile secretory function after warm hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat[J]．Liver Transpl,2003,9(11):1199-1210．

[3] Li X,Benjamin I S,Alexander B．Reproducible production of thioacetamide-induced macronodular cirrhosis in the rat with nomortality[J]．J Hepatol,2002,36(4):488-493．

[4] 王火平．肝硬化大鼠肝缺血再灌注后Bsep、Mrp2表达变化与胆汁淤积的关系[D]．宁波大学,2012．

[5] Arrese M,Trauner M．Molecular aspects of bile formation and cholestasis[J]．Trends Mol Med,2003,9(12):558-564．

[6] Doctor R B,Dahl R H,Salter K D,et al．Reorganization of cholangiocyte membrane domains represents an early event in rat liver ischemia[J]．Hepatology,1999,29(5):1364-1374．

[7] Diao L,Li N,Brayman T G,et al．Regulation of MRP2/ABCC2 and BSEP/ABCB11 expression in sandwich cultured human and rat hepatocytes exposed to inflammatory cytokines TNF-α, IL-6,and IL-1β[J]．J Biol Chem,2010,285(41):31185-31192．

[8] 舒明,余秋云,彭承宏,等．鼠肝热缺血再灌注后Bsep基因的表达及调控[J]．外科理论与实践,2007,12(1):63-66．

[9] Baghdasaryan A,Chiba P,Trauner M．Clinical application of transcriptional activators of bile salt transporters[J]．Mol Aspects Med,2014,(37):57-76．

[10] Lam P,Soroka C J,Boyer J L．The bile salt export pump:Clinical and experimental aspects of genetic and acquired cholestatic liver disease[J]．Semin Liver Dis,2010,30(2):125-133．

[11] Kojima H,Nies A T,Konig J,et al．Changes in the expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis[J]．J Hepatol,2003,39(5):693-702．

[12] Chang P,Hung D Y,Siebert G A,et al．Therapeutic effects and possible mechanisms of a snake venom preparation in the fibrotic rat liver[J]．Dig Dis Sci,2005,50(4):745-752．

Expression of Bsep and Mrp2 in liver of cirrhotic rats with intrahepatic cholestasis after ischemia-reperfusion injury

ObjectiveTo investigate the expression of Bsep and Mrp2 liver of cirrhotic rats with intrahepatic cholestasis after hepatic ischemia-reperfusion injury(HIRI)．MethodsForty five male sprague-dawley rats were randomly divided into 3 groups:normal rats with HIRI(group A),liver cirrhosis rats with sham-operation(group B)and cirrhotic rats with HIRI(group C)．The ischemia time was maintained for 30 min．The direct bilirubin(DBil)and total bilirubin(TBil)levels in bile and the DBil,TBil, AST,ALT level in serum were measured at d1,3,5 after operation．The expression of Bsep and Mrp2 proteins was detected by Western blotting and immunohistochemical method,ResultsThe DBil,TBil levels in the bile of group C were significantly lower than those of group A at d1 after operation(P＜0．05)and significantly lower than those of group A and B at d3(P＜0．05)．There was no significant difference among 3 groups at d5 after operation(P＞0．05)．Serum ALT and AST levels in group C were significantly higher than those in group A and B at d1 and d3(P＜0．05)．Serum TBil and DBil levels in group C were significantly higher than those in group A and B at d1,d3 and d5 after surgery(P＜0．05)．The expression of Bsep in liver cells of group C were significantly lower than that in group A at d1,d3 and d5,and lower than that in group B at d1 and d3．The expression of Mrp2 in group C was significantly lower than that in group A at d1,d3 and d5．Immunohistochemistry showed that Bsep protein was translocated to cytoplasm of liver cells in group C．ConclusionIschemic tolerance of cirrhotic liver is poor and intrahepatic cholestasis after HIRI in liver cirrhosis rats is more serious,which may be associated with the decreasied Bsep and Mrp2 protein expression and the abnormal translocation of Bsep to cytoplasm of liver cells．

Hepatic ischemia-reperfusion injury Cirrhosis Cholestasis

2014-12-04）

（本文编辑：李媚）

浙江省自然科学基金资助项目（Y2080096）

315010 宁波市第二医院肝胆外科（舒明），干细胞与再生医学实验室（胡笑蓉、黄左安、黄丹丹、王咖、张顺）；江西省九江市第三人民医院肝胆外科（王火平）

张顺，E-mail：worra123@163.com