5-脂氧合酶在小鼠恶唑酮溃疡性结肠炎中的表达研究

钟万锷 张海峰 周国雄

●基础研究

5-脂氧合酶在小鼠恶唑酮溃疡性结肠炎中的表达研究

钟万锷 张海峰 周国雄

目的 研究5-脂氧合酶（5-LOX）在恶唑酮诱导溃疡性结肠炎（UC）小鼠结肠黏膜中的表达情况，探讨其在UC发病机制中的作用及其与炎症程度的关系。方法 50只Balb/c小鼠分为正常对照组10只和模型组40只。模型组用3%恶唑酮致敏2d，第5天用0.5%恶唑酮灌肠。第8天用颈椎脱臼法处死所有小鼠。实验期间观察小鼠疾病活动指数（DAI），处死小鼠后行结肠组织学病理评分（HPS）。RT-PCR法检测结肠黏膜5-LOXm RNA的表达，免疫组织化学方法检测结肠黏膜5-LOX的蛋白表达情况。结果模型组DAI和HPS均高于对照组，5-LOXm RNA和蛋白表达也明显高于对照组（均P＜0.01），并随炎症程度加重，表达水平明显增高。结论 5-LOX在UC中表达水平明显升高，并参与了UC的发生和发展，在一定程度上可反应疾病的活动度，并且可能作为药物治疗的潜在靶点。

溃疡性结肠炎 5-脂氧合酶 RT-PCR免疫组织化学

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因、发病机制未明的反复发作的慢性非特异性肠道炎症。目前认为其发病可能与免疫、遗传、感染及精神等多种因素相互作用有关，免疫学因素是UC研究的热点之一。花生四烯酸（AA）是人体的一种必需脂肪酸，参与UC炎症发生、发展的整个过程。AA主要通过环氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）两条途径代谢。5-脂氧合酶（5-LOX）是AA的LOX代谢途径的关键酶，可催化AA生成白三烯B4（LTB4）。LTB4与炎症细胞上的LTB4受体相互作用，介导对中性粒细胞、单核细胞和效应性T淋巴细胞等炎症细胞向炎症部位趋化，LTB4被认为是UC中起主要作用的炎性介质[1]。小鼠恶唑酮结肠炎模型是一种Th2型结肠炎模型，组织学表现与人类UC相似[2]。本研究以恶唑酮诱导小鼠实验性结肠炎模拟人类UC，评估结肠炎症程度，通过RT-PCR和免疫组织化学的方法研究5-LOX在恶唑酮诱导小鼠UC中的表达情况，探讨5-LOX在UC发病中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 雌性Balb/c小鼠50只，4～6周龄，体重16～22g，由南通大学动物实验中心提供，饲养于南通大学动物实验中心屏障环境。称重、编号后随机分为正常对照组和模型组。正常对照组10只，无需特殊处理。模型组40只，参照Heller等[3]所用方法建立恶唑酮小鼠结肠炎模型。恶唑酮购于Sigma公司，小鼠背部皮肤剃毛（2cm×2cm），皮肤滴注3%恶唑酮（溶解于100%乙醇中）0.2ml，自然风干。1d后重复滴注1次；5d后将直径2mm的硅胶管经肛门插入肠道深约3cm，注入0.5%恶唑酮（溶解于50%乙醇中）0.15ml，注入后将小鼠倒置30s以防止回流。第8天用颈椎脱臼法处死所有小鼠。采集小鼠结肠标本备检。根据疾病活动指数（DAI）和结肠组织学病理评分（HPS）分为轻度炎症组5只、中度炎症组18只和重度炎症组17只。

1.2 结肠炎症评诂 造模过程中每日观察小鼠体重变化、大便性状、便血等情况。参照Murano等[4]所列标准进行DAI评分，DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。处死小鼠后取病变明显处，常规石蜡包埋、切片、HE染色，观察组织学改变，参照Wirtz等[5]所列标准进行HPS评分。

1.3 RT－PCR法测定5－LOX 提取总RNA，然后逆转录反应合成cDNA，取5μl cDNA用于PCR扩增。以GAPDH为内参照。GAPDH、5－LOX引物由上海生工生物科技公司设计并合成。5－LOX上游序列：5′TATCGATGGATGGATGGAGTGGAA3′，5－LOX下游序列：5′GACTGGAACATGTGCATGAAG3′，扩增产物大小为198bp。GAPDH上游序列：5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′，GAPDH下游序列：5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′，扩增产物大小为241bp。循环参数如下，5－LOX：94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，循环45次，80℃延伸20s。GAPDH：94℃变性20s，56℃退火20 s，72℃延伸30s，循环45次，80℃延伸20s。扩增后取PCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳。用凝胶分析系统对条带作半定量分析，读取其积分光密度（IOD）值，以5－LOX平均IOD值/GAPDH平均IOD值来表示5－LOX相对表达强度。

1.4 免疫组化方法测定5－LOX蛋白 采用Elivison二步法进行染色。加5－LOX（Caymana Chemical公司，工作浓度15μg/ml）作为一抗，每张切片加兔抗羊二抗（Jackson公司，工作浓度1∶500）。采用定量积分法，每张切片至少观察5个高倍视野100个细胞，对每张切片的阳性细胞比例及阳性细胞着色强度分别进行计分，以胞核或胞质中发现棕黄色或褐色颗粒状物者为阳性细胞，阴性对照应无棕黄色反应产物。采用以下染色积分评价标准[6]：染色强度分为4级，即阴性染色（0分），弱阳性染色（1分），中度阳性染色（2分），强阳性染色（3分）；每张切片按所见阳性细胞范围分为5级，即阴性为0分，阳性细胞占1%～25%为1分，阳性细胞占26%～50%为2分，阳性细胞占51%～75%为3分，阳性细胞占76%～100%为4分。每张切片的染色积分以染色强度与阳性细胞比例乘积之和表示。

1.5 统计学处理 采用STATA 12.0统计软件，计量数据用表示，组间比较采用t检验或方差分析。

2 结果

2.1 两组小鼠发病情况及DAI评分比较 对照组小鼠饮食、活动及大便性状正常，体重略有增加。模型组小鼠造模后第1天开始出现食量和活动减少，大便表现为稀便或半稀便，体重减轻；第3天开始出现便血或大便隐血（+～++）；体重减轻更加明显。与对照组相比，模型组DAI明显增高，差异有统计学意义，详见表1。

2.2 两组小鼠组织学观察及HPS评分比较 对照组小鼠结肠黏膜光镜下无组织损伤表现（图1）。模型组小鼠结肠黏膜不同程度水肿、出血、糜烂及溃疡形成，固有层腺体变形、排列紊乱，黏膜及黏膜下层可见密集分布的淋巴细胞和中性粒细胞浸润，偶见淋巴滤泡形成（图2）。与对照组相比，模型组HPS明显增高，差异有统计学意义，详见表1。

表1 两组DAI和HPS评分比较

图1 对照组小鼠结肠黏膜光镜下所见（HE染色，×100）

图2 模型组小鼠结肠黏膜光镜下所见（HE染色，×100）

2.3 两组小鼠5－LOXmRNA表达水平比较 模型组小鼠5－LOXmRNA表达上调，对照组5－LOXmRNA仅微弱表达（图3），两组比较差异有统计学意义，详见表2。

2.4 两组小鼠免疫组化染色积分比较 在对照组小鼠结肠黏膜组织中，5－LOX无或仅有弱阳性表达（图4），模型组与对照组比较，5－LOX表达显著增高（图5），差异有统计学意义（P＜0.01），详见表2。

表2 两组小鼠5-LOXmRNA表达水平、免疫组化染色积分比较

图3 两组小鼠5-LOXmRNA表达电泳图

图4 对照组小鼠结肠标本5-LOX表达（免疫组化染色，× 400）

图5 模型组小鼠结肠标本5-LOX表达（免疫组化染色，× 400）

3 讨论

UC的病因及发病机制至今仍不清楚，多数研究认为与免疫反应异常有关，尤其与肠黏膜局部免疫反应的异常关系密切，细胞因子在UC的发病中起着多重作用。肠道免疫系统存在着一种微妙的平衡，促炎因子与抗炎因子通过精细的调节维持宿主肠黏膜的防御能力，使肠组织免遭破坏，但这种平衡一旦打破，非特异性剌激和活化的炎症细胞均可产生并释放大量破坏性的免疫分子及炎症因子。各种细胞因子、炎性介质的相互作用形成复杂的甚至有自身放大作用的细胞因子网络，促进炎症反应，导致肠黏膜损伤，从而参与UC的发生、发展[7]。

我们的研究结果发现，在恶唑酮诱导的小鼠结肠炎模型中，5-LOX表达上调，炎症越重，5-LOX表达越强，而对照组小鼠5-LOX不表达或弱阳性表达。5-LOX是机体生成白三烯B4（LTB4）的关键酶，相对分子量为78kD，普遍存在于哺乳动物的各种组织和血液细胞中，主要见于白细胞、巨噬细胞和肥大细胞，细胞不同的状态可能有不同的5-LOX亚细胞定位[8]。5-LOX主要作用于炎症的后期，可以调节中性粒细胞的迁移浸润能力，促进黏附分子的表达和炎性介质的产生，增加肠黏膜渗透性，在UC组织损伤和炎症产生过程中具有重要的作用[9]。研究发现，大鼠结肠炎模型肠黏膜中5-LOX表达水平增高，应用5-LOX抑制剂可减轻大鼠结肠的炎症表现[10-12]。Mazzon等[13]观察5-LOX基因敲除的结肠炎模型小鼠，发现其腹泻和结肠炎症程度明显减轻，提示5-LOX与UC密切相关，5-LOX抑制剂可能对UC具有潜在的治疗价值。

因此，我们认为，5-LOX参与了UC的发生和发展，5-LOX通过催化花生四烯酸（AA）生成LTB4。LTB4与炎症细胞上的LTB4受体相互作用，介导对中性粒细胞、单核细胞和效应性T淋巴细胞等炎症细胞向炎症部位趋化，最终导致肠道黏膜炎症的发生。由此可见，5-LOX在UC发病中起了重要作用，可能成为潜在治疗的靶点。目前5-LOX在UC中的具体作用还不完全清楚，因此，进一步研究它们的作用机制有着重要意义。

[1]Schm id tC,BaumeisterB,KipnowskiJ,etal.Alteration ofp rostagland in E2and leukotriene B4 synthesis in chronic inflammatory bowel disease[J].Hepatogastroenterology,1996,43(12):1508-1512.

[2]Kojima R,Kuroda S,OhkishiT,etal.Oxazolone-induced colitis in BALB/Cm ice:a new method to evaluate the efficacy of therapeutic agents for u lcerative colitis[J].J Pharm acol Sc i,2004,96(3): 307-313.

[3]Heller F,Fuss IJ,Nieuwenhuis EE,etal.Oxazolone Colitis,a Th2 Co litis Model Resemb ling Ulcerative Colitis,Is Med iated by IL-13-Produc ing NK-TCells[J].Immunity,2002,17(5):629-638.

[4]Murano M,Maemura K,Hirata I,etal.Therapeutic effectof intracolonically adm inistered nuc lear factor kappa B(p65)antisense oligonuc leotide on mouse dextran sulphate sod ium(DSS)-induced colitis[J].Clinica l&Experimental Immunology,2000,120: 51-58.

[5]Wirtz S,NeufertC,Weigmann B,etal.Chem ically induced m ouse m odels of intestinal inflamm ation[J].Nat Protoc,2007,2(3):541-546.

[6]Koga H,Sakisaka S,OhishiM,et a l.Exp ression of cyc looxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma:relevance to tum or ded ifferentiation[J].Hepatology,1999,29:688-696.

[7]Neurath M F.Cytokines in inflamm atory bowel d isease[J].Nat Rev Imm unol,2014,14(5):329-342.

[8]Brock T G,Paine R 3rd,Peters-Golden M.Localization o f 5-lipoxygenase to the nuc leus of unstimulated rat basophilic leukem ia cells[J].JBio lChem,1994,269(35):22059-22066.

[9]Cuzzocrea S,Rossi A,Mazzon E,et al.5-Lipoxygenase modulates colitis through the regulation o f adhesion m olecule exp ression and neutrophilm ig ration[J].Laboratory Investigation,2005, 85:808-822.

[10]Singh V,PatilC,KulkarniS.Effectof5-lipoxygenase inhibition on events associated w ith in flamm atory bowe l d isease in rats[J]. Ind ian JExp Biol,2004,42(7):667-673.

[11]Noto T,Yamada H,Inui T,et al.Therapeutic Effects of Ecabet Sod ium,an Antiulcer Drug,on Dextran Sod ium Sulfate-Induced Ulcerative Colitis in Rats[J].Digestive Diseases and Sciences, 2005,50(5):922-927.

[12]Sklyarov A,Panasyuk N,Fomenko I.Role of nitric oxide-synthase and cyc looxygenase/lipooxygenase system s in deve lopm ent of experim ental ulcerative colitis[J].J Physiol Pharm acol, 2011,62(1):65-73.

[13]Mazzon E,Sautebin L,Caputi A,et al.5-Lipoxygenase Modulates the Alteration of Paracellular Barrier Function in Mice Ileum During Experim entalCo litis[J].Shock,2006,25(4):377-383.

Expression of 5-lipoxygenase mRNA and protein in colon mucosa of mice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis

ZHONG Wane, ZHANG Haifeng，ZHOU Guoxiong.
Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001, China

Objective To investigate the exp ression of 5-lipoxygenase(5-LOX)m RNA in colon mucosa in m ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis(UC).Methods Fifty female Balb/c m ice were divided into controlg roup(n=10)and UC g roup(n=40).Mice in UC g roup received subcutaneous injection of3%(w/v)oxazolone for 2d and subsequently received enema w ith 0.5%(w/v)oxazolone on d5 after sensitization.On d7 the m ice were sac rificed for harvestof colon sam p les;disease ac tivity index(DAI)and histopathologicalscore(HPS)were also evaluated.The exp ression of5-LOXm RNA and p rotein in colonmucosa were detected by RT-PCR and immunohistochem istry,respectively.Results The DAIand HPS were higher in UC g roup than those in controlgroup.The exp ression of5-LOXmRNA and p rotein were significantly increased in UC m ice com pared to controls (P＜0.01),and the exp ression was positively correlated w ith the severity of colonic inflammation.Conclusion The exp ression of 5-LOX is up-regulated in colon mucosa ofm ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis,which ind icates that 5-LOXmay be involved in the developmentofUC and 5-LOXm ightbe a potentialpharmacological target for treatmentofUC.

Ulcerative colitis 5-LOX RT-PCR Immunohistochem istry

2013-12-16）

（本文编辑：沈叔洪）

226001南通,南通大学附属医院消化内科(钟万锷现在宁波市第六医院消化内科工作)

周国雄,E-mail：zhouguoxiong@medmail.com.cn