消渴安糖方对糖尿病周围神经病变大鼠NO、ET的影响

姜俊玲，林寿宁，刘 鹏，张振锋

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（DM）最常见慢性并发症之一，导致患者致残率高、致死率高，但其发病机制较为复杂，中医药治疗DPN具有明显的优势。现代研究显示［1］：代谢异常及血管内皮损害对糖尿病周围神经病变的发生具有重要作用，内皮素（endothelin，ET）与 一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）参与了 DPN的发生发展。本研究通过实验观察消渴安糖方对DPN大鼠ET、NO的影响，探讨ET、NO在DPN发生发展过程中的意义，同时探讨消渴安糖方防治DPN的机制，为治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 药物 消渴安糖方由黄芪、党参、枸杞、山茱萸、黄连、沙参、牡丹皮、当归、桃仁、红花等药物配伍组成，运用现代工艺加工研制成免煎颗粒剂。

1.2 动物 健康清洁级Wistar大鼠，雄性，体重214～300 g，由广西中医药大学动物中心提供（许可证号：桂医动字11003号）。

2 实验方法

2.1 造模方法 大鼠喂养高糖高脂饲料配方［2］（组成：10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料，由广西中医药大学医学动物实验中心按要求制备）4周，禁食12 h后，将链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）用 0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液（pH4.4、4℃）避光条件下配成1%浓度溶液，按40 mg/kg剂量单次注射于大鼠左下腹腔内。72 h后尾静脉取血，用血糖仪测量血糖，血糖≥16.7 mmol/L者确定为DM模型大鼠［3-4］。空白对照组进行左下腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液（假造模），并在假造模后2周、4周测定血糖，以排除DM。DM造模成功后继续予高糖高脂饲养4周，制成DPN模型。

2.2 分组及给药 造模成功后，将50只DM大鼠随机分为5组，分别为：正常组、模型组、消渴安糖方预防组（预防组）、消渴安糖方治疗组（治疗组）、维生素E组（VitE组），每组动物各10只。预防组大鼠于造成DM模型后立即给予药物进行干预治疗；治疗组及VitE组大鼠造成DPN模型后，开始给药。预防组及治疗组灌服消渴安糖方颗粒，根据《中药药理实验方法学》［5］中人与大鼠体表面积换算方法（相当于60 kg成人剂量的3倍）换算消渴安糖方给药剂量为5 g/（kg·d），VitE组灌服VitE，给药剂量为40 mg/（kg·d）。模型组、正常组给予相同体积纯净水灌胃。各组动物连续给药6周后，麻醉、采血及取组织，测定各项指标。

2.3 指标检测与方法

2.3.1 血液制备 将大鼠用0.7%戊巴比妥钠溶液麻醉，心脏采血，3 000r/min离心10 min，分离血清，置4℃低温冰箱保存待用，测定NO水平。另取2 ml血液注入含7.5%EDTA二钠30 μl和抑肽酶 40 μl的试管中，混匀，4 ℃下 3 000 r/min 离心10 min，分离血浆于-20℃保存，测定前将样本置于室温复融，再次于4℃下3 000 r/min离心5 min，取上清测定ET水平。血清NO（南京聚力生物医学工程研究所提供）用硝酸还原酶法测定。ET（北京科美东雅生物技术有限公司提供）用放射免疫法测定。

2.3.2 组织制备 取出腓肠肌组织，吸去血迹，称重，尽快放入0.2 mol/L HAC 1 ml略做碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10 min，匀浆。4℃下3 000 r/min离心15 min，取上清-20℃保存，测定时用5倍以上PBS稀释，以调节pH值。

2.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析（AVOVA）和两两比较（LSD）法。

3 结 果

3.1 各组大鼠血清NO水平比较 模型组和各用药组的血清NO水平明显低于正常组（P<0.01）；经治疗后，预防组与治疗组的血清NO水平显著高于模型组（P<0.01）；预防组与治疗组的血清NO水平比较，差异显著（P<0.01），由此可见，消渴安糖方可提高血清NO水平，且预防性给药疗效优于治疗性给药。见表1。

表1 各组大鼠血清NO水平比较 （μmol/L，±s）

表1 各组大鼠血清NO水平比较 （μmol/L，±s）

注：与正常组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与治疗组比较，③P<0.01

组 别 n 血清NO正常组 10 100.13±1.30模型组 10 74.13±5.79①预防组 10 97.44±8.29①②③治疗组 10 85.44±6.71①②VitE 组 10 76.83±5.03①

3.2 各组大鼠血浆、肌肉组织ET水平比较 与正常组相比，模型组血浆及肌肉组织的ET水平明显升高（P<0.01），但经过治疗后，预防组与治疗组ET水平比模型组明显降低（P<0.01），且预防组的ET水平与治疗组比较，差异显著（P<0.05）。说明消渴安糖方可降低血浆及组织的ET水平，且预防性给药疗效优于治疗性给药。见表2。

表2 各组大鼠血浆、肌肉组织ET水平比较（pg/ml，±s）

表2 各组大鼠血浆、肌肉组织ET水平比较（pg/ml，±s）

注：与正常组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与治疗组比较，③P<0.05

组 别 n 血浆ET 肌肉组织ET正常组 10 16.39±2.39 34.08±3.75模型组 10 35.32±4.11① 73.82±8.96①预防组 10 23.57±3.95①②③ 42.59±6.11①②③治疗组 10 27.52±5.14①② 48.89±5.01①②VitE 组 10 31.51±3.73① 61.81±7.51①

4 讨 论

DPN发生率高，危害性大，发病机制复杂。众多研究认为DPN的发生是多种因素共同作用的结果，且大量临床和实验研究显示血管损害对DPN的发生具有重要作用。

ET和NO是血管内皮细胞合成和释放的血管活性物质。ET是目前为止发现的最强的内源性缩血管物质，在微循环障碍、组织缺氧等条件下，血管内皮细胞受损，导致ET释放增加；NO可通过血管内皮细胞释放血管舒张因子，使血管平滑肌松弛和血管舒张［6-7］。糖尿病时血管内皮损伤，ET、NO二者失衡引起血管内皮功能障碍，并最终导致糖尿病并发症的发生［8-9］。

中医认为DPN属中医“痹证”范畴，是在消渴病气阴两虚基本病机的基础上出现的本虚标实之证。病机关键为气阴两虚瘀血阻络，以本虚标实、夹痰夹瘀为特点。血瘀在DPN的发生、发展中所起的关键作用已被众多医家认可［10］。现代研究表明，活血化瘀类中药能改善血液高凝状态和微循环，提高神经细胞血氧供应，可有效改善DNP临床症状［11-12］。消渴安糖方是我院林寿宁教授在继承全国名老中医林沛湘教授治疗消渴经验方的基础上研制而成。该方具有益气养阴、活血化瘀之功效，基本上由两组药组成：一是补益药，方中黄芪性甘温，能益气补虚损，以助活血之品，使气旺血行，祛瘀而不伤正，助诸药周行全身，使血行四肢，瘀通荣至，诸症得解；党参、沙参益气健脾生津，与黄芪共为君药，共奏健脾益气之功。枸杞补益肝肾，平而不热，既可添精益髓、健骨强筋，又善止消渴，加强君药的效力；山茱萸平补肝肾，既补肝肾之阴，又能温补肾阳，助君药以达阴阳并补之功，两药用以为臣，此为治本之法。二是活血化瘀药，方中牡丹皮、桃仁、当归、红花活血化瘀，用以为佐，体现了治标之法。诸药合用，攻补兼施，标本兼治，谨守病机，既能恢复脾胃的运化功能，又可改善气血瘀滞状态。本课题组既往研究提示消渴安糖方联合胰岛素治疗不仅可以降血糖、改善糖尿病患者临床症状［13］，还具有改善微循环、保护内皮的功能［14］。

本实验研究结果表明：糖尿病大鼠血清NO含量较正常组明显下降，而ET则明显升高，导致两者间动态失衡，而体现在营养周围神经的微血管上，可致神经内膜低氧或缺氧，造成神经纤维轴索髓鞘变性。实验结果显示模型组ET水平高于预防组和治疗组，进一步证实了ET在DPN中的作用。本研究还显示ET水平和NO水平呈负相关，两者之间存在着反馈性调节作用。消渴安糖方可有效调节DPN大鼠的ET、NO间的动态平衡，从而有效保护血管内皮细胞、改善内皮细胞的功能，对DPN的发生、发展起到预防和延缓作用。同时也提示消渴安糖方的作用是多途径、多靶点、多环节的，为消渴安糖方临床治疗DPN提供了药理学理论依据。

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