菟丝子含药血清对TNF-α诱导凋亡蜕膜细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

秦明春，贺 兰，李 利，周英惠，林 忠，张 吉

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

蜕膜细胞的凋亡是母儿免疫耐受的重要机制。在妊娠早期，蜕膜退化主要是以凋亡的形式进行，如果在孕早期发生蜕膜的异常退化或凋亡，就会破坏蜕膜组织重建和滋养细胞侵入所达到的相对稳定的状态，从而影响妊娠的继续。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种重要的炎症和免疫调节因子之一，在孕早期，适量的TNF-α对妊娠的维持具有重要作用，但过量的TNF-α则会导致细胞过度凋亡甚至死亡，影响妊娠的继续［1］。Bcl-2与Bax均属于Bcl-2基因家族，Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，Bax与Bc1-2结合后可使Bc1-2失活，细胞凋亡增加。在外界因素的刺激下，细胞的生死最终取决于Bc1-2和Bax两种调控因子的平衡。菟丝子作为传统的“补肾安胎”圣药，已被广泛运用于各种妊娠病的保胎治疗中。本研究观察菟丝子含药血清作用于TNF-α诱导异常凋亡蜕膜细胞Bal-2和Bax蛋白的表达情况，拟从母胎界面蜕膜细胞的凋亡角度探讨菟丝子可能的安胎机理。

1 实验材料

1.1 标本来源 试验用标本于2013年11月13～23日取自广西中医药大学附属瑞康医院妇科门诊手术室，为正常妊娠40 d健康孕妇人流组织，经医院伦理委员会批准，并征得患者知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12培养基（批号AQK29046，Hyclone公司）；胎牛血清（批号 20130105，Hyclone公司）；胰蛋白酶（批号：ZJ0541，美国Amresco公司）；胶原酶Ⅱ（批号：20130-15，美国 Gibco 公司）；TNF-α（批号：10154，Biosource公司，分装）；兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（批号：50977904，购自北京中杉金桥生物技术有限公司）；一抗兔抗人Bcl-2、Bax、GAPDH多克隆抗体（1 mg/ml）购自美国CST公司；凝胶电泳成像分析系统（Gel Doc2000型）。其它试剂均为国产分析纯。

1.3 药物 菟丝子含药血清制备在广西中医药大学药学院药物制剂实验室进行，制备方法如下：将20只Wistar大鼠随机分为菟丝子组和空白组2组。制备菟丝子药液质量分数为170 g/L，给药剂量＝临床常用量×动物等效面积系数×5，每100 g体质量Wistar大鼠灌胃2 ml药液，空白组给予等量生理盐水灌胃，每日给药2次，连续1周。于最后一次给药1h后，无菌操作下采腹主动脉血，于4℃静置2 h后用低温离心机3 500 r/min离心15 min；收集血清经56℃恒温灭活30 min；用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。

2 方 法

2.1 原代蜕膜细胞的培养 参考文献［1-2］采用复合消化酶法对蜕膜细胞进行培养，将培养3代细胞在载玻片上爬片，采用链霉素-生物素-过氧化物酶法（SABC）法进行泌乳素（PRL）免疫组化染色。

2.2 人蜕膜细胞异常凋亡模型的建立及药物干预 以TNF-α诱导蜕膜细胞异常凋亡模型［3］。选取对数增长期生长良好的同一批细胞9瓶，每3瓶为一组，分别标记为对照组、模型组（予 TNF-α）、治疗组（予 TNF-α＋菟丝子含药血清）。TNF-α以预实验确定的10 ng/ml加入，含药血清以预实验确定的6%菟丝子含药血清加入，将细胞移入超净操作台，倾去旧的培养液，每瓶按组分别加入5 ml的条件培养液，置于37℃5%CO2培养箱中培养48 h后收集细胞。

2.3 蛋白质印迹法检测Bcl-2及Bax蛋白表达变化 细胞总蛋白样品提取，培养48 h后收集各组细胞，加入细胞裂解液作用1 min后用13 000 r/min离心15 min，吸取上清即细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，记录D595值，根据标准曲线计算蛋白浓度，调整蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸5 min冷却后上样，各组以GAPDH条带作为参照，取50 μg细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，通过半干转印转移至0.22 μm的PVDF膜，恒压23 V转膜45 min；PVDF膜经过封闭液封闭2 h后，加入多克隆抗体GAPDH以1∶1 000稀释，兔多克隆抗体Bcl-2及Bax以1∶300稀释，4℃孵育过夜，用TPBS漂洗膜2次，每次 10 min，PBS漂洗膜 1次 10 min。加入 1∶5 000 5%牛奶稀释的HRP标记的羊抗兔抗体作用液（1∶30 000稀释），于室温摇床上封闭1 h。用TPBS漂洗膜2次，每次5 min，PBS漂洗膜1次5 min。ECL化学发光，显影，定影，拍照；经Image Lab分析软件分析图像，统计分析比较各组Bcl-2、Bax蛋白与内参GAPDH的比值，进行统计学分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS17．0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表达，采用F检验分析处理各组间的差异，两两比较用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 蜕膜细胞的形态学观察及鉴定 本实验采用全组份蜕膜细胞的培养方式，接种后0.5 h即开始贴壁生长，呈较长的梭形状和不规则星形；HE染色核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，有丰富的胞浆颗粒。免疫组化染色见胞浆内细小棕色颗粒，越近细胞核，染色越强，阳性细胞计数结果显示95%的细胞PRL染色阳性，且细胞大小形态均一，说明本实验所用细胞为高纯度的蜕膜细胞。见图1。

图1 原代培养分离纯化蜕膜细胞

3.2 各组蜕膜细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达的变化 经蛋白印迹法检测模型组、治疗组和对照组人蜕膜细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达，硝酸纤维素膜电泳、显影后，出现了清晰的条带，见图2。经Image Lab分析软件分析图像，统计分析比较各组Bcl-2、Bax蛋白与内参GAPDH的比值，结果见表1。显示模型组的蜕膜细胞Bcl-2蛋白表达明显低于对照组（P<0.05），而Bax蛋白明显高于对照组（P<0.05）。与模型组比较，治疗组Bcl-2蛋白表达明显升高，Bax蛋白明显下降，均有显著性差异（P<0.05）。

图2 蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白在各组中的表达

表1 蜕膜细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达水平（±s）

表1 蜕膜细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达水平（±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别 Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Bcl-2/Bax对照组 0.58±0.10 0.64±0.05 0.90±0.07模型组 0.23±0.04① 1.14±0.11① 0.20±0.06①治疗组 0.41±0.09② 0.77±0.10② 0.54±0.16②

4 讨 论

妊娠是一个非常复杂而又协调的过程。胚泡植入后，子宫内膜在雌孕激素及溶解产物等作用下转化成蜕膜，它与子面滋养层共同构成了母胎界面，对妊娠的建立和维持至关重要。研究表明［4］，人早孕期蜕膜需要一定程度的退化，为滋养细胞的侵入提供空间，而这种退化就是以凋亡的形式发生的，但蜕膜细胞的凋亡有一定的时空限制，若凋亡细胞增加或发生异常凋亡，就可能会影响妊娠的继续。TNF-α是一种重要的炎症和免疫调节因子，早孕孕妇蜕膜组织中的TNF-α主要由激活的单核/巨噬细胞产生，体内适量的TNF-α对胚胎的生长发育可能是必需的，而病理状态下异常大量产生的TNF-α则会促使蜕膜细胞的过度凋亡及死亡，影响滋养细胞的侵入及胎盘的形成，影响胚胎发育［5］。Cinar O等［6］研究发现，与正常妊娠蜕膜相比，复发性流产患者蜕膜细胞凋亡明显增多，这提示大量凋亡的蜕膜细胞可能会导致一系列的细胞功能障碍，影响妊娠的维持。

细胞凋亡的发生机制与促/抑凋亡基因Bax和Bcl-2的表达密切相关。Bcl-2是一种凋亡抑制蛋白，主要通过线粒体途径影响细胞凋亡，而Bax主要通过拮抗或抑制Bcl-2的生物学活性来促进凋亡。正常妊娠早、中、晚期胎盘合体滋养层中均表达Bcl-2，妊娠晚期Bc1-2表达明显高于妊娠早、中期，Bc1-2在合体滋养层中的高表达可能对这些细胞有保护作用，使其不发生细胞凋亡，有利于滋养层存活［7］。Bcl-2/Bax途径可能是诱导早孕期蜕膜细胞凋亡的重要因素。Agata K B等［8］通过比较正常妊娠和胎儿生长受限（FGR）过程中Bax和Bcl-2在滋养层和蜕膜层的表达，发现了促凋亡蛋白Bax在胎盘表达增加，这可能是FGR发生的原因之一。

菟丝子为传统的补肾安胎药，其安胎功效已被长期的临床实践所证实。菟丝子黄酮为其主要成分，具有雌激素样活性及抗氧化、清除自由基等多种生物活性。有研究表明［9］菟丝子黄酮可以增加雌激素受体（ER）及促黄体激素受体（LHR）的表达。给予大鼠菟丝子提取物200 mg/kg灌胃，可以使摘除卵巢模型的大鼠小脑皮层及小脑深层核团中Bax蛋白的表达下调，Bcl-2蛋白的表达上调。在本实验研究中，TNF-α可以使体外培养的蜕膜细胞中Bcl-2蛋白的表达减弱，Bax蛋白的表达增强，而采用菟丝子含药血清干预后，可明显使TNF-α诱导的蜕膜细胞中Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱。因此，我们初步认为菟丝子可能通过降低病理状态下蜕膜细胞Bax水平，增高Bcl-2水平，从而抑制早期蜕膜细胞的异常凋亡而起到保胎作用。

［1］李雪莲，杜平，向亚莉，等.TNF-α在早期自然流产患者血清及蜕膜中的表达［J］.中国优生与遗传杂志，2011，19（5）：55-56.

［2］刘小丽，秦明春，于爱敏，等.人蜕膜细胞体外培养体系的建立［J］.实用预防医学，2007，14（5）：1335-1336.

［3］秦明春，王若光，李春梅，等.TNF-α诱导蜕膜细胞凋亡模型的建立及黄芩苷对蜕膜细胞凋亡影响的初步研究［J］.中国生物工程与临床康复，2007，11（19）：3793-3795.

［4］李泽莲，程玲慧，向卉芬，等.凋亡基因与早期妊娠结局的关系［J］.中国实用妇科与产科杂志，2013，29（6）：516-518.

［5］Wu Z M，Yang H，Li M，et al.Pro-inflammatory cytokinestimulated first trimester decidual cells enhance macrophage-induced apoptosis of extravillous trophoblasts［J］.Placenta，2012，33（3）：88-94.

［6］Cinar O，Kara F，Can A.Potential role of decidual apoptosis in the pathogenesis of miscarriages［J］.Gynecol Endocrinol，2012，28（5）：382-385.

［7］Soni S，Rath G，Prasad C P，et al.Apoptosis and Bcl-2 protein expression in human placenta over the course of normal pregnancy［J］.Anat Histol Embryol，2010，39：426-431.

［8］Agata K B，Anita S，Urszula K K，et al.Expression of caspase-3，Bax nad Bcl-2 in placentas from pregnancies complicated by treated and non-treated fetal growth restriction［J］.Ginekol Pol，2009，80（9）：652-656.

［9］阿依木古丽，蔡勇，范光丽.雌激素和菟丝子提取物对小脑中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响［J］.西北民族大学学报，2008，29（4）：53-58.