降压通络方对高血压肾损害大鼠肾脏血管紧张素II及肾功能的影响

韩琳 秦建国 高誉珊 王媛媛 张晓宇 郭一 宋林梅 罗燕妮 迟笑怡

降压通络方对高血压肾损害大鼠肾脏血管紧张素II及肾功能的影响

韩琳 秦建国 高誉珊 王媛媛 张晓宇 郭一 宋林梅 罗燕妮 迟笑怡

目的 观察降压通络方对自发性高血压肾损害大鼠肾脏血管紧张素II(angiotensin II，AngII)及肾功能的影响，探讨该方对高血压肾损害大鼠肾脏的保护机制。方法 采用16周龄自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertension Rat，SHR)为研究对象，将其随机分为模型组、缬沙坦组、降压通络方高、中、低剂量组、并设正常血压大鼠(Wistar Kyoto，WKY)为空白对照，分别灌胃给药。于给药后4周和8周分别测定大鼠尾动脉压力、血肌酐、尿素氮及肾脏AngII蛋白含量，并进行大鼠肾脏病理组织学检查。结果 给药4、8周后，与模型组比较，各治疗组大鼠血压、肾脏AngII含量明显降低(P＜0.01，P＜0.05)，但给药4周各组之间比较无统计学意义，给药8周缬沙坦及降压通络方高、中剂量组均明显低于低剂量组(P＜0.05);缬沙坦及降压通络方能显著降低模型组大鼠血肌酐、尿素氮(P＜0.01，P＜0.05)，改善肾小动脉及肾小球硬化，促进肾组织结构的恢复。结论 降压通络方能降低高血压肾损伤大鼠肾脏AngII含量，从而有效降低大鼠血压，改善肾脏病理损害，保护肾功能。

降压通络方; 自发性高血压大鼠; 高血压病肾损害; 血管紧张素II

高血压病是世界性常见疾病，近年来，随着高血压病早期防治及治疗措施改进，使得由高血压引起的心脑血管并发症明显下降，但高血压引起的终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)逐年增加，在美国高血压肾损害造成的ESRD占24%，欧洲占17%［1-2］，数据显示在中国2011年新增的透析患者中，由高血压肾损害引起的ESRD也占到9.9%，成为继原发性肾小球疾病、糖尿病肾病之后造成ESRD的第三大病因。在有关衰老的纵向研究发现，肾功能的损伤与平均血压和年龄有着密切的关系，二者成为肾功能下降的独立危险因素［3］。随着社会的老龄化，高血压肾损害已经引起人们的重视，对高血压病肾损害的发病机制和防治措施的研究已逐渐成为肾脏病学界的热点。现有的药物治疗措施虽然能部分的缓解症状，但不能影响高血压肾损害至终末期肾衰的进程，中医药对高血压肾损害的治疗显示了临床优势，但作用机制尚不清楚。本文采用自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)为研究对象，观察在高血压肾损害进程中降压通络方对损伤大鼠肾脏血管紧张素II(angiotensin II，AngII)及血压、肾功能的影响，探讨该方对高血压肾损害大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级16周龄自发性高血压大鼠(SHR)［4］72只，雄性，体重(200±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2002-0003。

1.2 药物与试剂

降压通络方由草决明15 g、黄芩15 g、菊花15 g、珍珠母30 g、丹参25 g、红花10 g组成，将上述中药水煮醇制取，制成水煎剂，分装灭菌备用。缬沙坦(由诺华制药有限公司提供)，血肌酐、尿素氮、以及AngII放免试剂盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要仪器

大鼠尾动脉血压测量仪(北京软隆生物技术有限公司);AE160型电子分析天平(瑞士Mettler公司);全自动石蜡切片机(英国Shandon);Eclipse 50i型显微镜(日本Nikon);紫外分光光度计UV-2000(尤尼柯上海仪器有限公司)。

1.4 动物分组与给药

实验过程中大鼠自由进食和饮水，分别置于代谢笼里取尿，检测尿蛋白和尿红细胞，结果均为阴性用于实验。将16周龄SHR大鼠随机分为模型组、降压通脉方高、中、低剂量组、缬沙坦组、并以同龄Wistar-Kyoto(WKY)大鼠为正常对照组，每组14只。降压通络方各组根据成人日用药量，按动物系数折算，大鼠的有效剂量为14.2 g/kg.d，以此做为中剂量，3倍递增设置高剂量42.6 g/kg.d，3倍递减设置低剂量4.73 g/kg.d;阳性药物对照组给予缬沙坦10 mg/kg.d，灌胃连续4周、8周;模型组及正常对照组给予等量的生理盐水。

1.5 大鼠血压的测定

所有大鼠于给药前、给药4周后、给药8周后用尾动脉血压测量仪测定各组大鼠尾动脉血压，记录大鼠清醒状态下的收缩压，每只大鼠每回测三次，取其均值作为该样本的收缩压。

1.6 大鼠肾组织病理形态学检查

于给药后4周、8周末每组各取7只大鼠，10%水合氯醛按0.4 mL/100 g体重腹腔麻醉，腹主动脉取血后处死大鼠，切取大鼠肾脏，留取部分新鲜肾组织用于放射免疫，部分肾组织按冠状位纵行剖开，置于4%多聚甲醛，石蜡包埋，切3μm切片，行HE染色，光镜下观察肾脏血管、肾小球及肾小管间质形态学改变。

1.7 大鼠血肌酐、尿素氮的测定

于给药4周、8周末每组各取7只大鼠，麻醉后腹主动脉取血2 mL，4℃，3000 r/min离心10分钟，分离血清，于EP管中保存。采用苦味酸法、二乙酰肟法分别测定血肌酐、尿素氮(按试剂盒说明书操作)。

1.8 大鼠肾脏AngII蛋白含量的测定

于给药4周、8周末随机各取7只大鼠杀检，取新鲜肾组织，吸取血迹，称重，快速放入生理盐水1 mL轻轻研磨，然后再100℃水浴中煮沸10分钟，再次研磨制成匀浆，4℃，3000 r/min离心15分钟，取上清-20℃保存，用放免试剂盒测定肾组织中的AngII含量(按说明书操作)。同时测定上清液中的蛋白含量予以校正。

表1 降压通络方对高血压肾损害大鼠血压的影响(±s，n=7)

表1 降压通络方对高血压肾损害大鼠血压的影响(±s，n=7)

注:与正常对照组相比aP＜0.01;与模型组相比bP＜0.05，cP＜0.01;与缬沙坦组相比dP＜0.05;与高剂量组相比eP＜0.05;与中剂量组相比fP ＜0.05

组别 给药前(mmHg) 给药4周(mmHg) 给药8周(mmHg)正常对照组132.57±11.86 129.29±9.96 114.43±8.77模型组 190.00±12.71a 202.43±10.74a 190.71±5.35a缬沙坦组 181.71±7.69a 188.43±4.35ac 169.43±4.61ac降压通络高剂组 186.57±4.83a 188.57±0.6.71ac 170.29±4.89ac降压通络中剂组 181.86±14.87a 190.29±11.21ab 171.29±4.72ac降压通络低剂组 191.00±12.81a 190.71±8.32ab 177.29±3.04acdef

1.9 统计学处理

数据资料以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，多组均数比较采用方差分析，组间差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间多重比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)检验。以 P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠血压的变化

SHR大鼠是基因敲除的自发性高血压大鼠，大鼠给药前血压测量结果显示模型及各治疗组较正常对照组Wistar大鼠血压明显增高(P＜0.01)，模型及各治疗组之间无显著性差异，证明其造模有效。给药4周后及8周后各治疗组大鼠血压与模型组比较显著降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，给药4 周时各治疗组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。给药8周后，缬沙坦组、降压通络方高、中剂量组均明显低于降压通络方低剂量组，其中缬沙坦组低于高剂量组，高剂量组低于中剂量组，但两组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。结果见表1。

2.2 大鼠肾脏组织病理形态学变化

大鼠肾组织HE染色结果显示:正常WKY大鼠肾组织切片未见明显异常，上皮细胞排列整齐，模型组大鼠可见入球小动脉玻璃样变性，小叶间动脉及弓状动脉肌的内膜增厚，肾小球缺血性萎缩，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，上皮细胞水肿、脱落坏死，管腔萎缩消失，管腔中偶见漏出的红细胞，间质纤维组织增生。各治疗组肾脏损伤情况较模型组明显改善。结果见图1、图2。

图1 给药4周后高血压肾损害大鼠肾脏病理形态的变化(HE染色×200)

图2 给药8周后高血压肾损害大鼠肾脏病理形态的变化(HE染色×200)

2.3 各组大鼠肾功能的变化

大鼠血肌酐结果显示:模型及各治疗组较正常Wistar大鼠血肌酐明显升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，给药4周后除降压通络低剂量组外，各治疗组与模型组比较血肌酐均明显降低(P＜0.01，P＜0.05);其中降压通络方高、中低剂量组低于缬沙坦组，但无显著性差异(P＞0.05);给药8周后各治疗组较模型组血肌酐明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，其中缬沙坦组、降压通络高剂量组明显低于低剂量组(P＜0.05)。结果见表 2。

表2 降压通络方对高血压肾损害大鼠血肌酐的影响(±s，n=7)

表2 降压通络方对高血压肾损害大鼠血肌酐的影响(±s，n=7)

注:与正常组相比aP ＜0.05，bP ＜0.01;与模型组相比cP ＜0.05，dP ＜0.01;与缬沙坦组相比eP ＜0.05;与高剂量组相比fP ＜0.05，gP ＜0.01

组别 给药4周Scr(μmol/L)给药8周Scr(μmol/L)正常对照组65.84±5.41 62.88±2.12模型组 75.79±3.19b 79.09±4.76b缬沙坦组 71.31±1.72bc 71.51±2.33bd降压通络高剂组 69.97±1.65ad 70.38±2.23bd降压通络中剂组 71.08±1.89bd 73.02±1.92bd降压通络低剂组 73.35±2.80bf 75.24±3.80bceg

大鼠尿素氮结果显示:模型及各治疗组较正常对照组Wistar大鼠尿素氮明显升高(P＜0.01)，给药4周后除降压通络低剂量组外，各治疗组与模型组比较均明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05);其中降压通络方高、中低剂量组低于缬沙坦组，但两组之间比较无显著性差异(P＞0.05);给药8周后除降压通络低剂量组外，各治疗组较模型组均明显降低(P＜0.01)，降压通络方高剂量组明显低于缬沙坦组及降压通络方中、低剂量组(P ＜0.01，P ＜0.05)。结果见表3。

2.4 各组大鼠肾脏AngII的含量的变化

模型及各治疗组较正常Wistar大鼠肾脏AngII含量明显升高(P＜0.01)，给药4周后缬沙坦及降压通络方各组较模型组AngII含量明显降低(P＜0.01，P ＜ 0.05)，但各组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。给药8周后各治疗组AngII含量较模型组明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，与缬沙坦组比较，降压通络方高剂量组略低于缬沙坦组，但无统计学意义(P＜0.05)，降压通络方中剂量、低剂量组AngII含量均高于缬沙坦组，但仅与低剂量比较有统计学意义(P＜0.01)，降压通络方高、中、低剂量各组之间比较均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，说明随着给药时间的延长，降压通络方呈剂量依赖性的降低高血压肾损伤大鼠肾脏AngII含量。结果见表4。

表3 降压通络方对高血压肾损害大鼠尿素氮的影响(±s，n=7)

表3 降压通络方对高血压肾损害大鼠尿素氮的影响(±s，n=7)

注:与正常组比较aP ＜0.01;与模型组相比bP ＜0.05，cP ＜0.01;与缬沙坦组相比dP ＜0.05;与高剂量组相比eP ＜0.05，fP ＜0.01

组别 给药4周BUN(mmol/L)给药8周BUN(mmol/L)正常对照组5.22±0.47 5.78±0.75模型组 7.83±0.47a 8.03±0.38a缬沙坦组 7.26±0.42ab 7.12±0.39ac降压通络高剂组 6.9±0.54ac 6.55±0.5acd降压通络中剂组 7.19±0.22ac 7.37±0.62abf降压通络低剂组 7.5±0.45ae 7.62±0.31af

表4 降压通络方对高血压肾损害大鼠肾脏AngII含量的影响(±s，n=7)

表4 降压通络方对高血压肾损害大鼠肾脏AngII含量的影响(±s，n=7)

注:与正常对照组相比aP ＜0.01;与模型组相比bP ＜0.05，cP ＜0.01;与缬沙坦组相比dP ＜0.01;与高剂量组相比eP ＜0.05，fP ＜0.01;与中剂量组相比gP＜0.05

组别 给药4周(pg/g) 给药8周(pg/g)正常对照组5.52±0.84 5.37±0.91模型组 8.02±0.32a 9.01±0.64a缬沙坦组 7.07±0.64ac 7.07±0.42ac降压通络高剂组 6.65±0.57ac 6.85±0.65ac降压通络中剂组 6.79±0.76ac 7.58±0.30ace降压通络低剂组 7.12±0.34ab 8.29±0.80abdfg

3 讨论

肾脏既是血压调节的重要器官，同时又是高血压损害的靶器官之一。高血压肾损害是原发性高血压常见而严重的慢性并发症之一，是终末期肾病的独立危险因素［5］。高血压肾损害的典型病理表现为肾小动脉的肌内膜肥厚和(或)细小动脉的玻璃样变，进而导致肾小球及肾小管的缺血性改变。另有一部分肾单位由于高灌注、高滤过和高跨膜压，引起肾小球肥大以及继发性局灶节段性肾小球硬化，后期表现为肾小球废弃性或固化性硬化，以及肾小管萎缩及间质纤维化［6］。高血压肾损害的发病机制十分复杂，Ang II在其发病机制机制中起着重要的作用［7-9］，Ang II是肾素血管紧张素系统(reninangiotensinsystem，RAS)的主要活性成分，它不仅是一种强有力的血管活性肽，可收缩肾小球入球和出球小动脉，引起肾小球毛细血管静水压升高，而且是一种生长因子，可刺激系膜细胞内DNA和蛋白质合成，导致系膜细胞增殖和肥大［10］。而目前对与高血压的治疗应用最广泛的为血管紧张素受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers，ARBs)和血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)类药物，ACEI和ARBs对改善肾脏血流动力学有重要的作用，但是目前仍然有50%的患者临床疗效不明显，而且ACEI药物在肾功能损害到一定程度(血清肌酐＞3mg/dl)时，应用受到限制，因此，进一步探索新的治疗方法和有效药物，将有利于延缓高血压肾损害向终末期肾衰的发展进程。

中医药对高血压肾损害的治疗显示了良好的临床效果［11-12］，但其取效机制有待于系统深入的研究。本课题组认为高血压肾损害的病机关键在于“肝阳上亢，肾络瘀阻”［13］，以“平肝通络”的治法祛除损害因素，畅通气血渗灌，以降压通络方治疗该病，该方由著名老中医郭士魁的降压通脉方名方发展而来，对心血管疾病疗效显著［14］，本课题组对该方进行化裁用于高血压肾损害的治疗，获得了很好的临床效果。为进一步探讨该方的取效机制，本课题组采用16周龄的自发性高血压大鼠为模型，以缬沙坦为阳性对照药，观察了降压通络方各剂量组对高血压肾损害大鼠肾脏AngII蛋白含量、尾动脉压力、肾功能及肾脏病理形态的影响。实验结果表明模型组大鼠血压随着病程的进展持续升高，降压通络方各剂量组在两个时间点对降低大鼠血压均显示了明显的效果，而且在两个时间点，治疗组大鼠肾脏AngII蛋白含量较模型组明显降低，随着用药时间的延长，给药8周末时课题组发现降压通络方呈剂量依赖性的降低大鼠肾脏AngII的蛋白含量，与此同时HE染色显示降压通络方各组大鼠肾组织的病理变化较模型组明显减轻，肾小球入球动脉及肾小动脉管壁增厚程度减轻，肾小球缺血改善，肾间质纤维化减轻。说明该方可能通过降低肾脏局部缩血管活性物质AngII，起到了降低血压，改善肾小球缺血，改善肾脏病理结构的作用。通过肾功能的检测本课题组亦发现降压通络方能够显著降低血肌酐、尿素氮的含量，而且随着用药时间的延长，降压通络方的高剂量组比缬沙坦组尿素氮的含量更低，显示了该方对于改善肾小球缺血，恢复肾脏的功能具有良好效果，但其生物学机制有待于进一步深入研究。

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Effects of Jiangya Tongluo Formula on the kidney and renal function in hypertension nephrosclerosis rats

HAN Lin，QIN Jian-guo，GAO Yu-shan，et al.School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100029，China

QIN Jian-guo，E-mail:qintdtg@163.com

Objectiveo observe the effects of Jiangya Tongluo Formula on the content of AngII in kidney and the renal function in the model of hypertension nephrosclerosis.MethodsSixteen-week-old Spontaneously Hypertension rats were used as research subjects and then the rats were randomly divided into 5 groups:a model group，a Valsartan group，3 Jiangya Tongluo groups and Wistar Kyoto rats were used as control group.All the rats were gavaged respectively.After 4 weeks and 8 weeks，the tail arterial pressure of the rats，Serum creatinine，Urea nitrogen and the dose of AngII in kidney were detected，At the same time，the histopathologic change in kidney tissue was also detected.ResultsAfter 4 weeks and 8 weeks gavage，compared to model group.The tail arterial pressure and the level of Ang II in kidney was decreased in Jiangya Tongluo groups and Valsartan group(P ＜0.01，P ＜0.05).But after 4 weeks gavage，there was no significant difference in therapeutic groups.After 8 weeks gavage，the date in Valsartan and Jiangya Tongluo high and medium dose groups were lower significantly than that of low dose group(P＜0.05).Valsartan and Jiangyatongluo degraded the concentration of SCr，BUN in blood-serum significantly(P ＜0.01，P ＜0.05)，improved the renal arteries and glomerular sclerosis，promoted the recovery of kidney tissue.ConclusionJiangya Tongluo Formula could reduce the level of Ang II in kidney ，decrease blood pressure，ameliorate renal pathologicallesion and protect renal function.

Jiangya Tongluo Formula;Spontaneously hypertension rat;Hypertension nephrosclerosis;Angiotensin II

国家自然科学基金(811734071)，北京中医药大学自主选题项目(2332012JYBZZ-JS004);北京市薪火传承郭士魁研究室项目(2011-SZ-A-27);北京中医药管理局双百工程金章安教授传承项目

100029北京中医药大学基础医学院解剖教研室［韩琳、高誉珊、王媛媛、宋林梅(硕士研究生)］;北京中医药大学东方医院肾内科［秦建国、张晓宇(硕士研究生)、郭一(硕士研究生)、罗燕妮(硕士研究生)、迟笑怡(硕士研究生)］

韩琳(1970-)，女，博士，副教授。研究方向:肾脏疾病的临床与基础研究。E-mail:hanlinxf89@sohu.com

秦建国(1971-)，博士，副主任医师，硕士研究生导师。研究方向:肾脏疾病的临床与基础研究。E-mail:qintdtg@163.com

R544.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.01.010

2014-05-29)

(本文编辑:蒲晓田)