新型基因重组藻胆蛋白对小鼠S180实体瘤COX-2 表达的影响

张晓平 侯 林 李慧芬 田景振

藻胆蛋白是来自藻类的一种捕光色素蛋白，其主要来自真核藻类——红藻、隐藻和原核藻类——蓝藻，某些甲藻也含有藻胆蛋白。藻胆蛋白因其广泛的作用越来越受到重视，在抗肿瘤、抗氧化、消炎以及消除体内自由基等方面具有很高的活性，藻胆蛋白抗肿瘤功效已经有了大量的报道［1，2］。环氧化物酶-2(COX-2)在炎症和肿瘤细胞中表达较高，COX -2抑制剂可抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的生成，从而诱导细胞凋亡。研究表明，藻胆蛋白能降低肿瘤细胞前列腺素(PEG2)的水平，使COX -2 的含量降低从而引起细胞凋亡，通过选择性抑制COX-2 活性达到促进肿瘤细胞凋亡的作用［3］。

本研究着眼于细胞水平，利用免疫组化的手段，探讨与肿瘤密切相关的环氧化酶-2(COX -2)蛋白表达的关系，继而研究了藻胆蛋白抑制肿瘤生长的方式与途径，探索新型基因重组藻胆蛋白抗肿瘤作用可能的作用机制，为新的抗肿瘤海洋药物的研发提供理论依据。

材料与方法

1.材料:(1)动物及瘤株:清洁级昆明小鼠50 只，体重18 ～23g，雄性，由山东鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室提供，动物合格证编号:SCXK(鲁)20080002;小鼠S180 实体瘤细胞(上海市细胞研究所生产)，采用常规方法小鼠体内腹腔传代。(2)药物和试剂:新型基因重组藻胆蛋白(实验室自制);藻胆蛋白从螺旋藻中提取(食品级螺旋藻粉由江苏赐百年公司生产，纯度1.0(A620 / A280);注射用环磷酰胺(CY，每瓶0.2g，江苏恒瑞医药股份有限公司生产);苏木色精(上海蓝季科技发展有限公司生产);30%过氧化氢(分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产);兔抗小鼠COX-2 多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司生产);SABC 试剂盒包括生物素化山羊抗兔IgG 5%即用型BSA SABC 工作液(武汉博士德生物工程有限公司生产);DAB 显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产)。(3)仪器:KD-202轮转式切片机(浙江省金华市科技仪器设备有限公司生产);生物图像分析系统(江苏捷达科技公司生产);OLYMPUS-BX50 显微镜(日本OLYMPUS 公司生产);ZMN -7803 型自动组织包埋机(常州华利电子公司生产);Simple PCI 图像分析系统(V5.2，CompixInc，美国生产)。

2.方法:(1)肿瘤动物模型的建立:将冻存的S180 肉瘤细胞复苏活化，并传代4 代。无菌抽取S180 肉瘤小鼠腹腔积液，高压灭菌，稀释，以0.2 毫升/只在小鼠腋下注射，24h 后随机分成5 组:阴性组给予生理盐水0.5ml 灌胃，新型基因重组藻胆蛋白按50mg/(kg·d)、实验室制备藻胆蛋白纯度1.0(A620/A280)按25、100mg/(kg·d)、进口高纯度藻胆蛋白纯度2.0(A620/A280)25、100mg/(kg·d)灌胃给药，环磷酰胺组30mg/(kg·d)腹腔注射，1 次/天，连续给药11 天。末次给药24h 后，处死剥瘤［4］。(2)免疫组化过程:肿瘤组织固定，病理常规脱水，石蜡包埋，切片，滴加COX -2 多克隆抗体。载玻片经脱蜡、复水后，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐微波15min 抗原修复，PBS 清洗，滴加BSA，37℃孵育20min，甩净液体，滴加1∶150 的抗体，4℃孵育过夜，加二抗工作液40 ～50μl，37℃孵育20min，滴加SABC 工作液，37℃孵育20min，加DAB 显色剂。显色后苏木精中复染，树胶封片。(3)COX-2 表达的检测:一般肿瘤细胞细胞质内出现棕黄色颗粒，认为是COX-2 阳性染色。选择5 个高倍视野，每个视野分别计数约500 个细胞，取阳性显色平均数并评分，若着色较深定为2 分，着淡色定为1 分，基本上不着色定为0分，着色的细胞占计数的细胞百分率:≥51%为3 分，26% ～50%为2 分，6% ～25%为1 分，≤5%为0 分，将每张切片染色细胞的百分率得分染色程度相乘的乘积为其最终得分［5］。COX-2 核周胞质薄膜上着色为阳性为判定标准。(4)光镜检查:免疫组化后切片镜检，观察各肿瘤细胞生长情况。

3.统计学方法:采用Simple PCI 图像分析系统对免疫组化结果进行分析，采用SPSS 17.0 进行数据处理，多组数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用F 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

各用药组小鼠S180 实体瘤组织中COX-2 表达与阴性组相比明显减少(P ＜0.05)。新型基因重组藻胆蛋白组与天然藻蓝蛋白组相比明显减少(P ＜0.05)，与环磷酰胺组相比差异不明显(P ＞0.05)，结果见表1。

COX-2 免疫组化主要在核周、胞质、胞膜上着色。在显微镜下观察可发现，阴性组细胞核在苏木精复染后有一定程度的不规则现象，阳性组细胞核不规则程度较轻，新型基因重组藻胆蛋白组、天然藻蓝蛋白组也有一定程度不规则性。结果见图1。

表1 5 组大鼠COX-2 表达测定结果(±s)

表1 5 组大鼠COX-2 表达测定结果(±s)

与阴性组比较，* P ＜0.05;与环磷酰胺组比较，#P ＜0.05

组别 剂量［mg/(kg·d)］n COX-2 平均阳性表达率(%)- 10 66.12 ±17.20环磷酰胺组 30 10 26.60 ±7.60*新型基因重组藻胆蛋白组 50 10 28.64 ±4.80* #天然藻胆蛋白(2.0)组 100 10 31.68 ±5.60*天然藻胆蛋白(1.0)组 25 10 42.38 ±18.40阴性组*

图1 各组免疫组化COX-2 检查结果(×400)

讨 论

天然藻胆蛋白生物活性广泛，但以天然藻胆蛋白为对象进行药物开发存在着许多问题，比如成本高、杂质多、周期长。随着重组DNA 技术的发展，胞内基因工程产物的数量不断增多，新型基因重组藻胆蛋白也可通过基因工程表达出来［6，7］。

环氧化酶(COX)又称前列腺素内过氧化物合成酶，是一种膜结合蛋白，在花生四烯酸合成前列腺素过程中第1 个限速酶，是一种双功酶其结构型酶为COX-1，诱导型酶为COX -2。COX-1 参与细胞正常生理功能，在多数细胞中恒定表达，而COX-2 在正常状态下几乎不表达，但在细胞因子、生长因子、丝裂素、癌基因等的诱导下表达。COX -2 的表达属诱导型，参与多种病理过程，其表达定位于核膜和内质网，在正常组织中不表达，而在恶性肿瘤中表达较高［8］。

COX-2 在核周、胞质、胞膜上着色，阴性组着色最深，平均阳性表达率达66.12%。新型基因重组藻胆蛋白组，环磷酰胺组，天然藻蓝蛋白2.0 组，天然藻蓝蛋白1.0 组与阴性组比较均有不同程度下调作用。新型重组藻胆蛋白作用的细胞出现典型的细胞核缩合，且一定浓度的藻蓝蛋白也会使细胞表现出DNA浓缩的现象，应用藻胆蛋白治疗的细胞在有关聚合酶断裂的研究中也有所表现，呈现出一定的裂解模式，藻胆蛋白降低肿瘤细胞前列腺素(PEG2)的水平，使COX-2 的含量降低从而引起细胞凋亡，且对脂多糖(LPS)诱导的吞噬细胞株增殖抑制作用与藻胆蛋白的剂量有关，呈现剂量依赖性。

新型基因重组藻胆蛋白对COX -2 的表达具有一定下调作用，COX -2 与炎症过程密切相关，COX-2 表达减少降低了其对免疫系统的抑制作用，从而间接起到抑制肿瘤作用，另外，减少了细胞的突变及肿瘤细胞的侵袭力，从而抑制肿瘤生长。

1 Manconia M，Pendas J，Ledon N，et al. Fadda phycocyanin liposomes for topical anti-inflammatory activity:in-vitro in-vivo studies［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61:423 -430

2 王庭健，林凡，赵方庆，等.藻胆蛋白及其在医学中的应用［J］.植物生理学通讯，2006，42(2):303 -307

3 徐清燕，梁慧，秦松.重组别藻蓝蛋白对小鼠H22肿瘤生长及COX-2、VEGF 和PCNA 表达的影响［J］. 青岛大学医学院学报，2010，46(1):22 -25

4 吴蕾，庞广昌，陈庆森.螺旋藻藻蓝蛋白的规模化提取和色谱纯化技术研究进展［J］.食品科学，2008，29(4):461 -463

5 陈智彬，宋永胜.Survivin、Caspase-3、突变型p53 对膀胱移行细胞癌预后的意义［J］.实用医学杂志，2009，25(3):348 -350

6 石荣莲，汪立平，刘玉佩.重组褐藻胶裂解酶基因工程菌超声波破碎条件研究［J］.湖南农业科学，2010，21:98 -101，104

7 徐清燕，梁惠，秦松.重组别藻蓝蛋白对小鼠H22 肿瘤生长及COX-2 VEGF 和PCNA 表达的影响［J］. 青岛大学医学院学报，2010，46(1):22 -25

8 Nardone G，Raco A，Vaira D，et a1.Expression of COX-2，PGE-synthasel，MDR-I(P-gp)，and Bcl-X1:a molecular pathway of Hpylori-related gastric carcinogenesis［J］.J Pathol，2004，202:305 -312