响应面法优化瓜蒌肽类物质提取条件

王明希， 雷海民

（北京中医药大学中药学院，北京100102）

响应面法优化瓜蒌肽类物质提取条件

王明希， 雷海民*

（北京中医药大学中药学院，北京100102）

目的探讨响应面Box-Behnben中心组合方法优化瓜蒌中肽类物质的提取。方法运用单因素实验方法确定提取过程中超声温度、超声时间、料液比等3个主要影响因素。在此基础上二次多项回归方程的ANOVA分析。结果

瓜蒌；肽类物质；响应曲面法

瓜蒌古称栝楼，是葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼T.rosthornii Harms的干燥成熟果实，主要分布于我国华南和西南地区。瓜蒌具有宽胸散结、润燥滑肠、清热涤痰等功效，为治疗胸痹的要药。现代药理学研究，其可抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝聚，且对肝损伤、心脑血管损伤有保护作用［1-3］。但是在2010年版 《中国药典》中瓜蒌的质量控制还停留在浸出物的测定阶段，无成分定量测定［4］。因此，对瓜蒌有效成分的进一步探索，便显得尤为重要。

肽（peptide）是由氨基酸的胺基 （-NH2）和羧基（-COOH）脱水缩合形成肽键后，形成的链状分子。随着肽类物质研究的深入，从中药中分离出具有提高免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、降脂降压等活性的肽类成分的报道日益增多［5-6］。一些研究也报道了瓜蒌中肽类物质的抗癌活性与使核糖体失活的作用［7-8］。因此，本实验探讨了响应面法优化瓜蒌中肽类物质的提取工条件，为其活性物质的分离、纯化、药理活性探究打下坚实的基础。

1 仪器与材料

FA2104S型电子分析天平 （上海光学仪器一厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗仪 （北京医疗设备二厂）；TDL-5-A CENTRZFUGE高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；R-1001-VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；JP-800B-8D型万能粉碎机 （久品工贸有限公司）。R13010042、R13010043 pH精密试纸 （上海楚柏实验室设备有限公司）。

瓜蒌产于山西省运城市新绛县，购于同仁堂，由北京中医药大学刘春生教授鉴定为栝楼T.kirilowii Maxim的干燥成熟果实。经晒干、切丝。

2 方法与结果

2.1 肽类物质的提取 将瓜蒌饮片粉碎，过40目筛。石油醚脱脂 （石油醚与瓜蒌粉末的比例为1∶4，脱脂4次，每次4 h），将脱脂后的瓜蒌粉末于通风阴凉处放置12 h，待用。精密称取瓜蒌粉末20 g于烧杯中，加入一定量去离子水，并且调节溶液pH值为8.4。将盛有样品的烧杯置于超声清洗仪中，超声频率为200 W。超声时间按照实验条件分别取50、60、70 min，离心 （3 500 r/min，15 min）取上清液，待用。再用1 mol/L的盐酸将上清液的pH值梯度调节到8.0、7.6、7.2、6.8、6.4、6.0、5.6、5.2，每一梯度均离心 （3 800 r/min，5 min）取沉淀，用相应的pH值溶液洗涤2～3次。将上述8份沉淀合并于烧杯中加入于沉淀同体积的去离子水，并将溶液pH值调节为7.0，沉淀溶解，呈澄清溶液，待用作为样品液。肽类物质的鉴定方法为 （1）双缩脲反应：取样品液2 mL于试管中加等体积双缩脲试剂，溶液由无色变为紫色。 （2）考马斯亮蓝反应：取考马斯亮蓝试剂2 mL于试管中，滴加样品液，溶液迅速由红色变为蓝色。说明此样品液中，含有肽类物质；糖类物质的去除方法为 （1）苯酚-硫酸法：取样品液5 mL于试管中加苯酚-硫酸试剂，无橙黄色化合物生成。（2）二硝基水杨酸法：取样品液5 mL于试管中加二硝基水杨酸试剂，无棕红色。表明糖类物质，除去效果较好。将样品液置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，待用。以此肽类物质粗提物的质量和原料质量比计算提取率。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声温度对提取率的影响 固定超声时间为60 min，料液比为1/30，其他提取条件不变。超声温度分别取30、40、50、60、70℃，每个温度点各做3次平行实验。此5个温度条件对应的提取率为 13.36、41.32、52.11、47.99、26.81 mg/g。在50℃时提取效果最好。随着温度升高，分子热运动增强，促进肽类物质溶出，提取效率增加。但是温度过高会导致肽类物质变性，随杂质离心去除。

2.2.2 超声时间对提取率的影响 固定超声温度为50℃，料液比为1/30，其他提取条件不变。超声时间分别取40、50、60、70、80 min，每个时间点各做3次平行实验。此5个不同超声时间对应的提取率为 20.11、44.72、53.12、46.09、22.78 mg/g。在60 min时提取效果最好。适当的超声时间，使肽类物质的在药材内与提取中达到动平衡，促进溶出。但过长时间处于50℃环境中，也可能导致肽类物质变性沉淀，耐高温杂质大量溶出，影响提取率。

2.2.3 料液比对提取率的影响 固定超声时间为60 min，超声温度为50℃，其他提取条件不变。料液比分别取1/10、1/20、1/30、1/40、1/50，每个料液比各做3次平行实验。此5个料液比条件对应的提取率为 9.32、21.22、49.56、30.32、18.02 mg/g。在1/30时提取效果最好。加提取液初期，水量较少时，瓜蒌粉末中果胶类、多糖类、纤维素吸水膨胀使溶液整体呈果冻状，肽类被包裹，溶出较少。随水量增大，而提取率增高。但是从料液比达到1∶30时提取率下降。料液比较大，大量肽类分散于提取液中，导致肽类物质在下一步离心、酸沉过程中，损失较多。

2.3 响应曲面法优化瓜蒌肽类物质的试验设计与结果 本次实验选用了响应曲面法中的Box-Behnben中心组合方法建立试验模型，在上述单因素试验的基础上，选择超声温度 （A），超声时间（B），料液比 （C）3个主要因素作为自变量，瓜蒌中肽类物质的提取率作为响应值。设计了3因素3水平的试验模型。试验设计见表1。

将试验数据运用Design Expert 8.0.6.1进行多元回归拟合，得出本次实验因变量瓜蒌肽类物质的提取率 （Y）与3个自变量超声温度 （A），超声时间 （B），料液比 （C）的二次多项回归方程如下：

Y=-505.3+8.810A+9.475B+2.930C-9.625E-0.030AB+0.019AC+0.020BC-0.085A2-0.079B2-0.085C2

此二次多项回归方程的ANOVA分析表，见表2。模型的F值为270.27，P＜0.000 1，有显著差异，证明造模成功。失拟项为0.074 5，没有显著差异，证明模型的失拟程度不大。R2为0.997 1表示模型的模拟程度较好良好。

表1 Box-Behnben中心组合方法试验设计及结果Tab.1 Box-Behnken test design and results

表2 二次多项回归方程的ANOVA分析Tab.2 Significance test resu lts of regression equation

3个自变量超声温度 （A），超声时间 （B），料液比 （C）的交互作用可通过3D图形、等高线图显现出来，见图1。

通过对比分析三个因素的等高线图与响应面图，可见三种因素之间的交互作用均较明显，坡面均较陡，呈钟罩型。其中超声温度 （A）与超声时间 （B）的响应面最陡，等高线间距小，对提取率的影响最大。

通过Design Expert软件的Box-Behnben中心组合法极值求解，可得瓜蒌中肽类物质的最佳提取工艺为：超声温度52℃，超声时间61 min，料液比为1/30。预测最高提取率为53.70 mg/g。

2.4 验证试验 根据响应面分析法得出的最优工艺，简化实验条件为超声温度52℃，超声时间61 min，料液比为1/30对瓜蒌中肽类物质进行提取，水平重复5次，得肽类物质的平均提取率为53.60 mg/g（RSD=2.845%）。与预测值较为吻合。

3 讨论

虽然种子类蛋白物质的提取工艺，已有大量文献［9-10］报道。但是含糖、油脂量较大的中药饮片中的肽类物质提取工艺，却鲜有报道。瓜蒌饮片为果实类药材，含有大量的果胶、多糖、纤维素、肽类、油脂类化合物等。不同于以往中药化学研究领域中的黄酮、生物碱等小分子活性物质，这些生物大分子在溶出过程中均以胶体形式存在，物理、化学性质相似，大大增加了肽类物质的提取难度。尤其是，至今尚未有多糖与肽类物质的各自保持活性的通用分离方法。Sevag法虽然可以使肽类物质从混合溶液中沉淀出来，但肽类物质因接触氯仿、三氯醋酸，并经过剧烈振摇，已丧失活性。生物化学领域较为成熟的动物蛋白提取方法，会严重造成肽类种类的缺失，均不适合照搬应用于中药材的研究过程中。

肽类物质在提取过程中极易变性沉淀，造成提取效率下降，有效物质活性降低。易使其变性的化学条件有强酸、强碱、重金属盐、有机试剂等；易使其变性的物理方法有加高温、紫外线照射、剧烈振荡或搅拌等。提取条件些许的变化即可严重影响肽类物质的提取率。本次实验，提取条件均能较温和，pH选用范围小，经碱提酸沉后，沉淀复溶为澄清溶液，表示没有破坏其空间结构。提取过程中无需长期高温加热，没有使用有机试剂，很好的保持了瓜蒌肽类物质的活性。料液比、超声时间、超声温度三个提取条件的适宜选择，使肽类物质的提取率显著增加。

响应曲面法（response surface methodology，RSM）可以分析因变量与多个自变量间的回归关系，多用二项式回归方程进行统计结果的表达。其可将自变量与因变量的函数关系用3D图形展示出来，结果直观、简洁［11-12］。Box-Behnben中心组合法试验方案中没有将所有试验因素同时安排为高水平的试验组合，可以安全、有效的指导试验进行，已被广泛使用［13-14］。这种方法尤其适用于多因素交叉影响产率的实验，因此，我们选用了响应曲面法中Box-Behnben中心组合方法首次建立提取瓜蒌中肽类物质的实验模型，对其提取条件进行了合理优化。

本次实验运用响应曲面法得出最佳提取工艺为：超声温度52℃，超声时间61 min，料液比为1/30.04。预测最高提取率为53.70 mg/g。最优工艺条件下实际肽类物质的平均提取率为53.60 mg/g。与预测值较为吻合。综上，响应曲面法可准确优化瓜蒌肽类物质的提取工艺，为含糖、油脂量较大的中药饮片的肽类物质提取工艺的研究发展，提供了可靠参考。

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Response surfacemethodology for optim ization of the extraction of peptides from Trichosanthes kirilowii M axim.

WANGMing-xi， LEIHai-min*
（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Trichosanthes kirilowii Maxim.；peptides；response surfacemethodology

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1221-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.014

2014-07-17

国家自然科学基金项目 （81173519）；北京中医药大学创新团队资助项目 （2011-CXTD-15）

王明希 （1990—），女，硕士，研究方向为中药活性寡肽分析分离方法的构建。Tel：18511896085，E-mail：wmx6085@ 126.com

*通信作者：雷海民（1968—），男，教授，博士生导师，研究方向为中药活性寡肽分析分离方法的构建。E-mail：leihaimin@126.com

瓜蒌肽类物质的最佳提取条件为：超声温度52℃，超声时间61 min，料液比为1/30。在此条件下，瓜蒌中肽类物质预测最高提取率为53.70mg/g。实验验证值为53.60mg/g。结论瓜蒌肽类物质的提取时的实际值与响应曲面法预测值较为接近。