皮下注射异丙肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚模型

张文斌 唐其柱 李 金 向仕钊 胡哲夫

心肌肥厚是指心脏在长期压力负荷、心肌梗死、冠状动脉疾病等因素的刺激下产生的一种泵血功能增强、心室壁张力减弱的适应性改变，是心力衰竭、心律失常及猝死的独立危险因素，是众多心血管疾病的共同病理过程［1，2］。小鼠心肌肥厚模型的构建主要有手术和药物两种方式，手术方式分为腹主动脉结扎术、升主动脉结扎术和颈总动脉结扎术等，其病死率高且效率低［3］； 药物主要为皮下泵注血管紧张素Ⅱ等激动剂，使小鼠全身小动脉收缩而引起血压升高，最终导致心肌肥厚，但血管紧张素Ⅱ等半衰期极短［4］。与其他交感神经递质相比，ISO 不仅半衰期相对较长，能更真实的模拟自然病程，而且皮下注射ISO 方法也更为简单、经济。此外，大鼠皮下注射ISO 诱导心肌肥厚模型的文献较多，但小鼠的相关文献较少且方法报道不一致［5］。本研究通过向C57 品系小鼠皮下注射ISO 构建心肌肥厚模型，探讨ISO 在对心肌肥厚模型构建的效果及其激活的相关信号通路，尤其是MAPK 家族信号通路的作用［6］。

材料与方法

1.实验动物及试剂： SPF 级C57 雄性小鼠( 8 周龄，25 ±2g) 的20 只，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于武汉大学人民医院实验动物中心SPF 级动物室。动物实验的操作均参照美国《实验动物管理和使用指南》，且经过武汉大学人民医院动物管理和使用中心的批准。ISO( I5627) 购自Sigma公司； 一 抗P - ERK( 4370P) 、T - ERK( 4695) 、P - JNK(4668P) 、T-JNK(9258) 、GAPDH(2118) 均购自CST 公司；二抗：IRDye 800CW 购 自LI - COR Biosciences； PVDF 膜 购 自Millipore 公司；ANP 引物购自上海生物工程股份有限公司，上游引物：5' -ACCTGCTAGACCACCTGGAG-3'；下游引物：5' -CCTTGGCTGTTATCTTCGGTACCGG-3'；TRIzol 来自于Invitrogen 公司；SYBR Green 1Master Mix 试剂盒购自Roche 公司。

2.实验方法：(1) 心肌肥厚小鼠模型的构建： 将C57 雄性小鼠随机分为对照组( NS 组) 与模型组( ISO 组) ，每组10 只，于早晚两次分别皮下注射剂量为5mg/kg 的生理盐水与ISO，连续注射2 周。(2) 超声检查： 将NS 组与ISO 组小鼠用异氟烷麻醉后剃去颈部及前胸壁的毛，暴露前胸壁，涂抹超声耦合剂后进行超声检查，测得射血分数。(3) 取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，固定四肢，由颈部沿左锁骨中线剪开胸腔，暴露心脏后将心脏完整剪下，挤去心腔内残余的血液，在分析天平上称量心脏重量并记录，随后一部分小鼠心脏切除心房与右心室，将剩下的左心室装入冻存管放液氮中保存，最后放入-80℃冰箱冷藏，另一部分心脏生理盐水冲洗后放入装有甲醛溶液的尿杯保存；暴露肺后将肺完整剪下，擦去表面血液，在分析天平上称量肺重量并记录； 剪开小鼠腿部肌肉测量其胫骨长度并作记录。(4) 病理切片：取出保存在甲醛溶液中的组织，固定后常规脱水透明，石蜡包埋，修整蜡片，切成厚度为5μm 的薄片，染色封片后放到显微镜下摄取图像。NS 组与ISO 组各有4 张切片，每张片随机拍摄10 个视野，每个视野随机挑选5 个细胞，即每组统计200 个心肌细胞横截面积。(5)心肌蛋白的提取：取-80℃冰箱保存的组织迅速置于干冰上，将样本放入准备好的EP 管中，放入6 颗小钢珠，加入裂解液，盖好EP 管盖。将EP 管放入研磨仪研磨罐中，随后将研磨罐安装在研磨仪上，30 下/秒研磨90s。取出EP 管，倒出钢珠，4℃离心。将收集下来的细胞残液用超声裂解仪裂解，放置15min 后离心，取上清分装至EP 管。BCA 法定量蛋白质浓度，分装后-80℃冰箱保存。( 6) 反转录- 聚合酶链反应( RT-PCR) ：在心肌组织中提取RNA，计算浓度与纯度，放入-80℃冰箱保存。然后取出RNA，反转录合成cDNA 第1 链，产物用于PCR。取PCR 管加入cDNA、上、下游引物、MIX、灭菌去离子水等，离心混匀后进行PCR 反应。产物琼脂糖凝胶电泳后用紫外分析仪观察有无特异性扩增带，并拍照记录。(7) Western blot 法检测分析： 等体积蛋白质( 10μl) 经聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS - PAGE) 分离后，转移到聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜上，加入7%脱脂牛奶放摇床上室温封闭1h 后，用含有Tween-20 的Tris-HCl 缓冲盐溶液( TBST) 洗涤，加入一抗放入4℃冰箱摇床过夜。取出蛋白膜放入二抗稀释液中避光孵育1h，孵育结束后用TBST 洗涤，放入荧光检测仪中检测。

3. 统计学方法： 应用SPSS 19.0 统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s) 表示，采用配对t -检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.药物注射后存活率比较： 分别注射ISO 与NS 2 周后，两组小鼠的存活率均为100%。

2. 超声结果比较： 注射2 周后，ISO 组小鼠的EF%与NS 组相比有明显下降，可认为造成了小鼠心脏病理性的改变，差异有统计学意义( 图1) 。

图1 NS 组小鼠与ISO 组小鼠射血分数

3.两组组织重量的比较： 取材称重后，ISO 组小鼠的HW、HW/BW、LW、LW/BW 比与NS 组相比均增高，差异有统计学意义( 图2、图3) 。

图2 NS 组小鼠与ISO 组小鼠心重/体重比( HW/BW)

4.两组心肌细胞横截面积的比较： ISO 组小鼠心肌细胞横截面积较NS 组有显著提高，差异有统计学意义( 图4) 。

5.两组中心钠肽( ANP) 的比较：ISO 组小鼠ANP较NS 组有显著提高，差异有统计学意义( 图5) 。

6.Western blot 法相关蛋白表达结果：与NS 组相比，ISO 组P-ERK、P -JNK 等MAPK 家族信号通路标志物表达均增强( 图6) 。

图3 NS 组小鼠与ISO 组小鼠肺重/体重比( LW/BW)

图4 NS 组与ISO 组小鼠心肌细胞横截面积( CDA)

图5 NS 组与ISO 组小鼠心肌细胞ANP 表达

图6 MAPK 信号通路相关蛋白表达

讨 论

本实验采用皮下注射ISO 制备小鼠心肌肥厚模型，发现注射ISO 2 周后，小鼠心重/体重比、肺重/体重比明显增加；心肌细胞横截面积增大； 心肌肥厚相关蛋白及标志物P - ERK、P - JNK、ANP 等表达升高，这些结果均证明了ISO 可以诱导小鼠心肌肥厚，而ISO 组小鼠射血分数与NS 组相比有了明显的降低，说明小鼠心脏有了病理性的变化，成功构建了心肌肥厚疾病的动物模型。

众所周知，心肌肥厚是指心肌对容量负荷或压力负荷的增大而产生的一种适应性的改变。但伴随着心肌细胞的不断肥大以及心肌细胞内蛋白质的不断沉积，这种生理性的适应会发展为病理性的改变［7］，成为众多心血管疾病发生、发展过程中的共同病理过程与疾病恶化的重要因素，最终导致心力衰竭，引起患者的死亡［8］。

临床研究表明，交感神经系统过度兴奋主要通过增加压力负荷诱导心肌肥厚的发生、发展过程［9］。而在心肌肥厚动物模型构建中也证明了这一点，兴奋小鼠交感神经系统也成为构建心肌肥厚模型的主要方法［10］。ISO 作为一种β 受体激动剂，可激活小鼠交感神经系统，进而构建心肌肥厚的动物模型。心肌肥厚的发生、发展与细胞信号通路的激活密切相关，MAPK 家族信号转导通路、AMPK 信号转导通路、Wnt信号转导通路、Jak - STAT 信号转导通路等相互作用，从而导致心肌肥厚［11］。而作为相关信号通路基础的MAPK 家族信号通路可被由血流动力学改变引起的心室壁机械压力的增强所激活［12］。越来越多的研究也证明，MAPK 家族信号通路在心肌细胞的增殖、分化、凋亡过程中起到重要作用，在心肌肥代偿性肥厚到病理性肥厚的转换中起到了重要作用［13～15］。Western blot 法结果显示P -ERK、P -JNK 等标志蛋白表达增强，说明ISO 通过激活MAPK 家族信号通路可导致心肌肥厚。

综上所述，通过皮下注射ISO 2 周即可成功模拟慢性压力负荷心肌肥厚的动物模型，与手术构建心肌肥厚模型相比，本研究方法不需要开腹、开胸，对小鼠的损害小，动物模型成活率高； 与皮下泵注血管紧张素Ⅱ等神经递质构建心肌肥厚模型相比，方法能更真实的模拟自然病程，更加易于操作，同时也更为经济，可以大量复制心肌肥厚模型。因此，皮下注射ISO 能更简单、经济、可靠的获得小鼠心肌肥厚模型，为心肌肥厚相关机制的进一步的研究打下坚实的基础，为临床上治疗心肌肥厚提供提供新的靶点。

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