牛粪纤维素降解菌的筛选与初步鉴定

牛明芬+武肖媛+于海娇+梁文娟+王思博

摘要：通过“富集—初筛—复筛”流程，筛选出4株对纤维素有强降解能力的菌株，分别标记为TG1、HN1、HP2、P3。对4株菌的纤维素酶活性进行了定量测定；通过生理生化试验，初步鉴定TG1为放线菌，HP2为地衣芽孢杆菌，P3、HN1为枯草芽孢杆菌。

关键词：纤维素降解菌；分离；纤维素酶活；鉴定

中图分类号：Q939.9文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0393-02

随着我国养牛行业的发展，牛存栏量也逐年增加。根据调查显示，2009年我国奶牛存栏量达1260万头，2010年的存栏量达1420.1万头。存栏量为200～2000头的肉奶牛基地，每天可产生的牛粪在5～50t[1]。未经处理的牛粪随意堆放，不仅造成了人们的视觉污染，而且对大气、土壤、水造成了很大污染。相较于其他畜禽粪便，牛粪含纤维素、半纤维素等有机难降解物质比较多，自然降解时间长[1-2]。

针对牛粪中含纤维素较多且自然降解时间长的特点，本试验将降解纤维素能力强的菌株分离筛选出来，以期用于后续的牛粪堆肥试验缩短牛粪堆肥发酵时间。

1材料与方法

1.1样品采集

土壤样品采自沈阳建筑大学树林落叶堆积处；牛粪样品采自本溪木兰花牛场的鲜牛粪、腐熟牛粪、堆积1年的牛粪。落叶堆积处取样时，在土层5～10cm处进行采样，平面采样用“之”字形取样，剖面取样采用定点取土[3]。

1.2培养基

培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏合成一号、刚果红纤维素钠筛选培养基、滤纸条液体培养基、羧甲基纤维素钠培养基、牛肉膏蛋白胨酪素培养基、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）液体发酵培养基[3]、豆饼粉液体发酵培养基。

1.3试验方法

1.3.1纤维素降解菌的富集分别称取5g不同的采集样品，置于45mL装有玻璃珠无菌水的三角瓶中，放入30℃、120r/min的摇床，培养1d。

1.3.2纤维素降解菌的筛选（1）初筛：用稀释涂布平板法，将10-7～10-4浓度的菌液涂于刚果红纤维素钠筛选培养基上，将平板分别放入30、50℃恒温箱培养4d，挑取明显的单菌落在PDA培养基上进行划线纯化，将纯化好的菌种接入PDA培养基斜面保存。（2）复筛：将纯化好的菌株点接到羧甲基纤维素钠培养基上，放入30、50℃培养4d，用刚果红染液进行染色，量取菌圈直径（d）和透明圈直径（D），并计算透明圈直径与菌圈直径比值D/d，选取D/d值与D值大的菌接入滤纸条液体培养基中，进行滤纸条崩溃试验，观察滤纸条崩溃的快慢和程度。选取使滤纸条崩溃程度大的菌，分别接种于CMC-Na液体发酵培养基、豆饼粉液体发酵培养基上，培养64h，测定纤维素酶活性。

1.3.3粗酶液的制备取发酵液倒入离心管中，3000r/min下离心10min，上清液即为粗酶液。

1.3.4纤维素酶活性测定[4-5]（1）羧甲基纤维素酶（CMCase）活性测定：根据GB20287—2006《农用微生物菌剂》进行羧甲基纤维素酶活测定；（2）滤纸酶（FPA）活性测定：根据NY/T1847—2010《微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求》进行滤纸酶活性测定。

1.3.5纤维素降解菌的初步鉴定[6-7]对筛选出的菌株菌落形态及显微镜下的形态进行观察，并进行生理生化试验。通过对照伯杰氏手册完成对菌株的初步鉴定。

2结果与分析

2.1菌种初筛

通过刚果红纤维素钠筛选培养基的筛选，共获得21株菌，其中从土壤中分离出来的菌有9株，都为常温菌；从牛粪中共分离出来12株菌，其中常温菌6株，高温菌6株。将分离出来的菌在PDA培养基划线纯化后接种到PDA斜面保存，待用。

2.2菌种复筛

用刚果红染色羧甲基纤维素钠与滤纸条崩溃试验进行菌种复筛，测试菌株的纤维素降解能力，详见表1。王志超等认为D/d值超过2.5的菌株纤维素酶活性高[8]。也有人认为，D>2cm时，酶活较高。从表1可以看出，菌株P1、HN1的D/d值超过了2.5，且透明圈直径D大于2cm；菌株P3、HP2、TG1、TG4的D/d值接近2.5，且透明圈直径D大于或接近2cm，纤维素酶活性也相对比较高。

选用P1、HN1、TG1、HP2、P3做滤纸条崩溃试验，试验结果见表2。由表2可以看出，接种TG1滤纸条崩溃得最快最明显，P1最不明显。

综合刚果红染色羧甲基纤维素钠与滤纸条崩溃试验，筛选出HN1、TG1、HP2、P34株菌进行后续纤维素酶活性的定量测定与菌株的初步鉴定。

2.3纤维素酶活性的测定结果

将筛选得到的4株菌分别接入CMC-Na液体发酵培养基、豆饼粉液体发酵培养基中，培养64h，对其进行CMCase酶活性和FPA酶活性的测定，结果见表3。

由表3可以看出，TG1在CMC-Na液体发酵培养基中产生的酶活性要高于其在豆饼粉液体发酵培养基中的；HN1、HP2、P3这3株菌在豆饼粉液体发酵培养基中的酶活性要高些，可以在后续的发酵优化试验中作为参考菌株。

2.4纤维素降解菌的初步鉴定结果

2.4.1TG1鉴定结果（1）菌落特征：在高氏合成一号培养基上长的比较快，菌落为圆形，中间凸起，初期为白色，之后菌落出现灰色粉末物质，易被挑取，有强烈的土腥味。（2）显微观察结果：革兰氏染色为阳性，可看到孢子丝呈直形。根据以上试验结果初步鉴定TG1为放线菌。

2.4.2P3鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上干燥，呈半透明、边缘不规则状，培养基背面微发黄，有一定黏度，不易挑取。（2）显微观察结果：菌株P3呈短杆状，有芽孢生成。（3）生理生化试验结果：菌株P3为好氧菌，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为25～30℃，可使明胶液化，V-P反应与甲基红试验呈阳性，可降解淀粉，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐，在初始pH值为9的培养基中生长良好。根据以上试验结果初步鉴定P3为枯草芽孢杆菌。endprint

2.4.3HN1鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色，圆形，不透明，边缘为波浪状，有褶皱，有黏度，不易挑取。（2）显微观察结果：菌株HN1呈短杆状，芽孢中生。（3）生理生化试验结果：菌株HN1为好氧菌，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应呈阳性，甲基红试验呈阴性，可降解淀粉，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐，不能在厌氧环境中生长，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HN1为枯草芽孢杆菌。

2.4.4HP2鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上长势良好，菌落呈大片状，向外扩张，不透明，背面呈现红色，易挑取。（2）显微观察结果：菌株HP2呈短杆状，芽孢端生。（3）生理生化试验结果：菌株HP2可在有氧环境中生长，也可在厌氧条件下生长，在厌氧环境中生长产生红色色素，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应与甲基红试验呈阳性，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐与丙酸盐，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HP2为地衣芽孢杆菌。

3结论与讨论

本试验从腐熟的牛粪与土壤中共分离出21株对纤维素有分解能力的菌株，土壤中分离出的9株菌均为常温菌，牛粪中分离出6株高温菌和6株常温菌。通过刚果红染色羧甲基纤维素钠与滤纸条崩溃试验进行复筛，筛选出4株对纤维素降解能力强的菌株。

用2种基础发酵培养基对筛选出的4株菌进行纤维素酶活性的定量测定，发现菌株P3、HN1、HP2在豆饼粉发酵培养基中的酶活性较高，TG1在CMC-Na发酵培养基中的酶活性较高，在下一步进行发酵培养基优化中可做参考。FPA酶活与CMCase活性高低不一致，说明降解纤维素的酶是一种纤维素复合酶。经初步鉴定，HP2为地衣芽孢杆菌；P3、HN1为枯草芽孢杆菌；TG1为放线菌。在牛粪降解菌中的细菌多为芽孢杆菌[9]，这与本试验结果一致。

参考文献：

[1]任平，赵文娟，张强，等.不同微生物酶对牛粪堆肥腐熟的影响[J].安徽农业科学，2010，38（5）：2525-2526，2592.

[2]方华舟，王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析[J].中国土壤与肥料，2012（6）：88-92.

[3]孙一博.高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2013：1-53.

[4]GB20287—2006农用微生物菌剂[S].

[5]NY/T1847—2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求[S].

[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978.

[7]布坎南RE，吉布斯NE.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京：科学出版社，1984

[8]王志超，陆文静，王洪涛.好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究[J].北京大学学报：自然科学版，2006，42（2）：259-264.

[9]刘佳，李婉，许修宏，等.接种纤维素降解菌对牛粪堆肥微生物群落的影响[J].环境科学，2011，32（10）：3073-3081.endprint

2.4.3HN1鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色，圆形，不透明，边缘为波浪状，有褶皱，有黏度，不易挑取。（2）显微观察结果：菌株HN1呈短杆状，芽孢中生。（3）生理生化试验结果：菌株HN1为好氧菌，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应呈阳性，甲基红试验呈阴性，可降解淀粉，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐，不能在厌氧环境中生长，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HN1为枯草芽孢杆菌。

2.4.4HP2鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上长势良好，菌落呈大片状，向外扩张，不透明，背面呈现红色，易挑取。（2）显微观察结果：菌株HP2呈短杆状，芽孢端生。（3）生理生化试验结果：菌株HP2可在有氧环境中生长，也可在厌氧条件下生长，在厌氧环境中生长产生红色色素，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应与甲基红试验呈阳性，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐与丙酸盐，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HP2为地衣芽孢杆菌。

3结论与讨论

本试验从腐熟的牛粪与土壤中共分离出21株对纤维素有分解能力的菌株，土壤中分离出的9株菌均为常温菌，牛粪中分离出6株高温菌和6株常温菌。通过刚果红染色羧甲基纤维素钠与滤纸条崩溃试验进行复筛，筛选出4株对纤维素降解能力强的菌株。

用2种基础发酵培养基对筛选出的4株菌进行纤维素酶活性的定量测定，发现菌株P3、HN1、HP2在豆饼粉发酵培养基中的酶活性较高，TG1在CMC-Na发酵培养基中的酶活性较高，在下一步进行发酵培养基优化中可做参考。FPA酶活与CMCase活性高低不一致，说明降解纤维素的酶是一种纤维素复合酶。经初步鉴定，HP2为地衣芽孢杆菌；P3、HN1为枯草芽孢杆菌；TG1为放线菌。在牛粪降解菌中的细菌多为芽孢杆菌[9]，这与本试验结果一致。

参考文献：

[1]任平，赵文娟，张强，等.不同微生物酶对牛粪堆肥腐熟的影响[J].安徽农业科学，2010，38（5）：2525-2526，2592.

[2]方华舟，王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析[J].中国土壤与肥料，2012（6）：88-92.

[3]孙一博.高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2013：1-53.

[4]GB20287—2006农用微生物菌剂[S].

[5]NY/T1847—2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求[S].

[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978.

[7]布坎南RE，吉布斯NE.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京：科学出版社，1984

[8]王志超，陆文静，王洪涛.好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究[J].北京大学学报：自然科学版，2006，42（2）：259-264.

[9]刘佳，李婉，许修宏，等.接种纤维素降解菌对牛粪堆肥微生物群落的影响[J].环境科学，2011，32（10）：3073-3081.endprint

2.4.3HN1鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色，圆形，不透明，边缘为波浪状，有褶皱，有黏度，不易挑取。（2）显微观察结果：菌株HN1呈短杆状，芽孢中生。（3）生理生化试验结果：菌株HN1为好氧菌，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应呈阳性，甲基红试验呈阴性，可降解淀粉，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐，不能在厌氧环境中生长，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HN1为枯草芽孢杆菌。

2.4.4HP2鉴定结果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上长势良好，菌落呈大片状，向外扩张，不透明，背面呈现红色，易挑取。（2）显微观察结果：菌株HP2呈短杆状，芽孢端生。（3）生理生化试验结果：菌株HP2可在有氧环境中生长，也可在厌氧条件下生长，在厌氧环境中生长产生红色色素，革兰氏染色为阳性，生长最适温度为45～50℃，可使明胶液化，V-P反应与甲基红试验呈阳性，产过氧化氢酶，能还原硝酸盐，可在0～7%盐浓度中生长，能利用柠檬酸盐与丙酸盐，在初始pH值为8～9的培养基中生长良好。根据以上试验结果，初步鉴定HP2为地衣芽孢杆菌。

3结论与讨论

本试验从腐熟的牛粪与土壤中共分离出21株对纤维素有分解能力的菌株，土壤中分离出的9株菌均为常温菌，牛粪中分离出6株高温菌和6株常温菌。通过刚果红染色羧甲基纤维素钠与滤纸条崩溃试验进行复筛，筛选出4株对纤维素降解能力强的菌株。

用2种基础发酵培养基对筛选出的4株菌进行纤维素酶活性的定量测定，发现菌株P3、HN1、HP2在豆饼粉发酵培养基中的酶活性较高，TG1在CMC-Na发酵培养基中的酶活性较高，在下一步进行发酵培养基优化中可做参考。FPA酶活与CMCase活性高低不一致，说明降解纤维素的酶是一种纤维素复合酶。经初步鉴定，HP2为地衣芽孢杆菌；P3、HN1为枯草芽孢杆菌；TG1为放线菌。在牛粪降解菌中的细菌多为芽孢杆菌[9]，这与本试验结果一致。

参考文献：

[1]任平，赵文娟，张强，等.不同微生物酶对牛粪堆肥腐熟的影响[J].安徽农业科学，2010，38（5）：2525-2526，2592.

[2]方华舟，王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析[J].中国土壤与肥料，2012（6）：88-92.

[3]孙一博.高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2013：1-53.

[4]GB20287—2006农用微生物菌剂[S].

[5]NY/T1847—2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求[S].

[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978.

[7]布坎南RE，吉布斯NE.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京：科学出版社，1984

[8]王志超，陆文静，王洪涛.好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究[J].北京大学学报：自然科学版，2006，42（2）：259-264.

[9]刘佳，李婉，许修宏，等.接种纤维素降解菌对牛粪堆肥微生物群落的影响[J].环境科学，2011，32（10）：3073-3081.endprint