2种海洋弧菌的鉴定及人工感染大黄鱼病理分析

2015-01-15陈心马蓉张艺石志祥

江苏农业科学 2014年11期

陈心+马蓉+张艺+石志祥

摘要：从形态学、生化特性、分子生物学水平对2种海洋弧菌进行菌种鉴定，将这2株菌制作成混合菌液，对大黄鱼进行攻毒试验。对2菌株16SrDNA进行PCR扩增，产物长度分别为1389、1477bp。利用BLAST进行比对，结果显示菌株090625的序列与哈维氏弧菌的同源性高达99%；而菌株070925的序列与副溶血弧菌同源性高达99%。攻毒试验发现，大黄鱼体亲鱼表皮下出血和肝脏、脾脏等组织都出现了典型的弧菌感染病症，大黄鱼幼鱼则未出现感染现象。菌株090625为哈维氏弧菌，菌株070925为副溶血弧菌。大黄鱼亲鱼比幼鱼更容易感染细菌。

关键词：菌种鉴定；哈维氏弧菌；副溶血弧菌；大黄鱼

中图分类号：S944文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0251-03

随着海水养殖业的蓬勃发展特别是高密度养殖模式的推广，养殖生物的细菌性疾病发生频率和发病范围逐渐增大。据调查，在细菌性疾病中，弧菌属细菌引起的疾病占很大比例。弧菌属细菌广泛存在于沿岸海水[1]、沉积物、海洋动物体中，被认为是海水鱼、虾、蟹类的一种常见致病菌[2-4]。大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）隶属于鲈形目（Perciformes）石首鱼科（Sciaenidae），主要分布于中国、朝鲜沿海水域，为我国主要海产经济鱼类之一[3]。随着大黄鱼亲鱼培育和人工育苗等关键技术的突破，以及人工养殖技术的不断提高，大黄鱼养殖产业得到迅猛发展。但由于养殖规模扩大等原因，各种病害发生也日益频繁，尤其是细菌性疾病严重威胁着大黄鱼养殖业的健康发展[5-7]。本研究从患病中华乌塘鳢（Bostrychussinensis）内分离出致病菌，对大黄鱼进行人工感染，观察病症发生情况，旨在为大黄鱼临床诊断、致病机理研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源2种海洋弧菌从患病中华乌塘鳢中分离。

1.1.2供试材料健康大黄鱼（均质量0.5kg）购自福建省宁德市养殖网箱；患病中华乌塘鳢（均质量0.5kg）由福建省东山县鑫宇海水养殖场提供；健康褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus，平均质量0.5kg）购自福建省厦门市大学路水产市场。

1.1.3试剂蛋白胨（tryptone，LP0042）、酵母提取物（yeastextract，LP0042）、TCBS培养基均购自英国Oxoid公司；RNAlater购自北京Bioteke公司；ExTaqDNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.4仪器设备自动微生物检测系统（AMS）VITEKJR和自动微生物检测系统革兰氏阴性菌种鉴定卡为法国生物梅里埃公司产品；9700型PCR仪为美国PE公司产品；水平电泳槽为北京六一仪器厂产品；恒温培养箱为太仓市华美生化仪器厂产品；HVE-50型全自动高压灭菌锅为日本Hirayama公司产品；AFX-1002-P型艾科浦超纯水系统为台湾颐洋企业发展有限公司产品；血小板计数器为浙江玉环县求精医用仪器厂产品。

1.2方法

1.2.1菌株分离用1.5%无菌生理盐水反复清洗患病中华乌塘鳢体表。用75%乙醇拭擦体表，对取样部位进行消毒。用无菌接种环分别穿刺体表溃烂部位组织，取少量样品在TCBS培养基上划线，30℃培养1d。挑取优势菌落在TCBS培养基平板划线分离数次，直至获得纯培养物菌株1、菌株2。

1.2.2回归感染取15尾健康褐菖鲉置于水箱中，28℃海水充气暂养2d，每天换水1/2。暂养无异常后用于回归感染，将其中10尾鱼分为A、B2个试验组，另外5尾为对照组。用血小板计数法对菌株1、菌株2进行计数；用无菌生理盐水分别将菌株1、菌株2稀释，制成菌悬液1、菌悬液2，浓度均为1×1010CFU/mL。A组：每尾鱼腹腔注射0.2mL菌悬液1；B组：每尾鱼注射0.2mL菌悬液2；对照组：每尾鱼注射0.2mL灭菌生理盐水。观察、记录试验鱼发病及死亡情况。

1.2.3菌株再次分离取回归感染试验组中出现病灶的褐菖鲉体表溃烂部位样品，在TCBS培养基和LB培养基平板上划线分离数次，直至得到纯化菌株。

1.2.4菌株鉴定

1.2.4.1形态学观察利用肉眼直接观察细菌菌落的外部形态。

1.2.4.2生化特性鉴定从分离菌株中取单菌落，利用自动微生物检测仪VITEKJR的GNI鉴定卡进行生理生化鉴定，再分离菌株经自动微生物检测仪GNI鉴定卡，检测30个生化检测项目。

1.2.4.3分子生物学方法鉴定将单菌落用ddH2O溶解，用作PCR反应的模板。以16SrRNA的保守区设计引物，进行PCR扩增，其中正向引物为16S-F（ATCGAACGCTGGCGGCAGGC），反向引物为16S-R（TCACCCCAGTCATGAAC）。PCR扩增反应体系：10×exTaqbuffer5μL，exTaqDNA聚合酶0.25μL（1.25U），dNTP4μL（各2.5mmol），模板DNA2μL（约0.5μg），引物1（16S-R）1μL（10μmol），引物2（16S-F）1μL（10μmol），加灭菌去离子水补足体积至20μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸7min。接着进行电泳检测。将5μL样品和2μL6×上样缓冲液混合，加入点样孔进行电泳。电压为120V，约30min。电泳结束后，将琼脂糖胶放入紫外灯下观察。回收有目的条带的样品。配制1%TAE琼脂糖胶进行产品回收。PCR产物检测、测序。

1.2.5攻毒材料的制备将鉴定出的2种菌株涂布于LB培养基，30℃培养16h。用1.5%生理盐水溶解菌株，2种菌株在生理盐水中的最终浓度为1×108CFU/mL。采用哈维氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌悬液为攻毒材料，比例为3∶1。endprint

1.2.6攻毒试验

将大黄鱼（均质量400g）分别置于约25℃的海水中暂养2d。分为1个试验组、1个对照组，每组4尾鱼。加入1～2滴丁香酚于水桶中麻醉试验用鱼。对试验组注射混合菌液，注射剂量为1mL/kg；对照组注射同等剂量的生理盐水。随时观察攻毒组和对照组鱼体的活动情况，并及时进行记录和拍照。

2结果与分析

2.1病原菌的获取

采用无菌操作挑取样品、细菌分离培养等方法，从福建省东山县鑫宇海水养殖场患病中华乌塘鳢皮肤溃烂的病灶部位分离得到2种病原菌。2种菌株在TCBS平板上的菌落基本为黄色，圆形，隆起，边缘整齐，不透明，其中1种较为黏稠。

2.2回归感染结果

回归感染3d后，A组褐菖鲉全部死亡，B组有3尾褐菖鲉死亡。死亡褐菖鲉肝脏和鳃的颜色发白，胆囊肿大，有的个体尾鳍和臀鳍边缘出现轻微溃疡。未死亡的试验鱼对外界刺激反应迟钝，鳍出血，体表病变的部位有暗红色瘀血，鳞片脱落，皮肤出现溃烂，表现出典型的弧菌病病症。对照组褐菖鲉表现正常。从患病褐菖鲉重新分离纯化感染菌株，进行生化和分子生物学鉴定。

2.3病原菌鉴定

2.3.1菌落外部形态鉴定

回归感染后再分离获得的菌株，在TCBS平板上98%以上的优势菌落基本为黄色，菌落均为圆形、隆起、边缘整齐、不透明；其中菌株2较为黏稠。菌落直径约1mm，另外在大量优势菌落中还夹杂少数绿色和菌落直径约2mm的浅黄色菌落，均生长良好。回归感染后鉴定，将菌株1命名为090625，菌株2命名为070925。

2.3.2生理生化检测再分离菌株经自动微生物检测仪GNI鉴定卡，结果见表1。其中，葡萄糖氧化、生长控制、蔗糖发酵等都显阳性，具有典型的海洋弧菌生化特性。根据全自动细菌鉴定仪检测结果，初步判断这2种菌株均为海洋弧菌。

2.3.3分子生物学鉴定

以再分离菌株菌液为模板，利用PCR方法，扩增出2条大小为1000～2000bp的条带。经过测序，得出2条长度分别为1389、1477bp的DNA链（图1、图2）。BLAST程序搜索NCBI基因库中所有已登录的同源序列，结果显示菌株090625的序列与哈维氏弧菌最为相似，同源性高达99%；而菌株070925的序列与副溶血弧菌最为相似，同源性也高达99%。据此确认菌株090625为哈维氏弧菌，菌株070925为副溶血弧菌，并将二者的16SrRNA部分序列上传GenBank，登录号分别为GQ327950、EU170469。

2.3.4大黄鱼攻毒试验结果

2.3.4.1体表病变情况分析

对大黄鱼亲鱼（已注射催产素）和大黄鱼幼鱼同时进行攻毒试验。结果发现，攻毒后的大黄鱼出现典型的海洋弧菌病灶。攻毒18h后，部分大黄鱼亲鱼浮上水面，胸鳍、腹鳍、尾鳍、鳃盖等部位均有出血症状，鳞片出现脱落（图3）。

2.3.4.2大黄鱼体内各组织病变特征分析

通过解剖发现，大黄鱼幼鱼头肾、肝脏等组织结构清晰，保持较为完整状态。但患病亲鱼的头肾、肝脏等组织出现糜烂等症状（图4）。

3结论与讨论

菌种鉴定是一项繁琐的工作。海洋细菌数量繁多、种类复杂，特别是同一属菌株间性质相似度较高，更增加了鉴定工作的难度。因此，通常须要同时采用多种仪器、生化指标、试验手段，经综合测定分析后才能较准确鉴定细菌种类[8]。本

研究首先采用选择性培养基TCBS进行病原菌培养。TCBS培养基上形成的菌落基本为黄色，其中含有少量绿色菌株。在TCBS培养基上，菌落呈圆形，隆起，边缘整齐，表现出海洋弧菌在TCBS培养基上生长的典型症状。培养过程中，发现

菌株070925较为黏稠，与副溶血弧菌的特性相符[9]。哈维氏

弧菌在过夜培养时，培养温度低于30℃时可以正常生长，而副溶血弧菌的培养温度必须维持在30℃才能过夜培养，该结果与副溶血弧菌对低温较为敏感的报道[10-12]一致。在生理生化水平方面，采用自动微生物检测系统（AMS）和鉴定卡GNI进行菌种鉴定，结果表明2种病原菌均为海洋弧菌。另外，参照文献中葡萄糖氧化、生长控制、蔗糖发酵等生化特征[13]，初步判断这2种菌为海洋弧菌。最后根据16SrDNA序列确定为哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。

哈维氏弧菌和副溶血弧菌是条件性致病菌[14]。随着养殖水域生态环境的恶化，海洋弧菌已成为引起鱼类病害的主要致病菌之一。本研究通过人工感染发现，哈维氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌液对大黄鱼具有较强的毒力，针对不同体质的大黄鱼，其致病性有所不同。大黄鱼亲鱼更容易感染细菌，同时显示出较明显的病症，而对于幼鱼而言，其致病性相对较弱。

本研究对2种海洋弧菌进行了鉴定，同时对2种不同生理状态的大黄鱼感染2种海洋弧菌的发病机制进行了初探，这为大黄鱼人工繁育、亲鱼抗病力的研究提供了理论基础，也为大黄鱼免疫机制的深入研究奠定了基础。

[HS2*3][HT8.5H]参考文献：

[1]VezzulliL，PezzatiE，Huete-StaufferC，etal.16SrDNApyrosequencingofthemediterraneangorgonianParamuriceaclavatarevealsalinkamongalterationsinbacterialholobiontmembers，anthropogenicinfluenceanddiseaseoutbreaks[J].PLOSOne，2013，8（6）：e67745.

[2]DupontS，Carré-MloukaA，DescarregaF，etal.DiversityandbiologicalactivitiesofthebacterialcommunityassociatedwiththemarinespongePhorbastenacior（Porifera，Demospongiae）[J].LettersinAppliedMicrobiology，2014，58（1）：42-52.endprint

[3]NiuSF，JinY，XuX，etal.Characterizationofanovelpiscidin-likeantimicrobialpeptidefromPseudosciaenacroceaanditsimmuneresponsetoCryptocaryonirritans[J].Fish&ShellfishImmunology，2013，35（2）：513-524.

[4]阎斌伦，秦国民，暴增海，等.三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分离与鉴定[J].海洋通报，2010，29（5）：560-566.

[5]倪海儿，王国良.网箱养殖大黄鱼溃疡病的预报模型[J].水产学报，2009，33（2）：334-341.

[6]王军，苏永全，张朝霞，等.闽南地区养殖大黄鱼细菌性疾病的病原生物学研究[J].厦门大学学报：自然科学版，2001，40（1）：85-91.

[7]卫玮.大黄鱼对鳗弧菌减毒活疫苗免疫应答差异表达基因的筛选与鉴定[D].上海：华东理工大学，2010：58-60.

[8]覃映雪.养殖青石斑鱼（Epinephlusawoara）溃疡病细菌病原及其DNA疫苗的研究[D].厦门：厦门大学，2005：15-17.

[9]夏小安，吴清洋，李远友，等.锯缘青蟹混合感染症致病菌的分离鉴定与感染治疗[J].热带海洋学报，2010，29（5）：103-110.

[10]邱德全，蔺红苹，谭龙艳.一株副溶血弧菌噬菌体生理特性的研究[J].微生物学通报，2007，34（4）：735-739.

[11]丁云娟，彭勇，林洪，等.一株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及生理特性[J].[HJ2.1mm]微生物学通报，2011，38（11）：1639-1646.

[12]钟琳红，陈吉祥，姜莹安，等.非可培养状态哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）复苏后生理特征及毒力相关基因表达[J].海洋与湖沼，2010，41（3）：435-439.

[13]HoltJG.Bergeysmanualofdeterminativebacteriology[M].Ninthedition.Baltimore：WilliamsandWilkins，1993：345-367.

[14]AustinB，AustinDA.Bacterialfishpathogens：diseasesoffarmedandwildfish[M].4thed.Chichester：Springer-Praxis，2007：189-202.endprint