10种金发藓科植物RAPD分子系统学研究

郑艳冰+丛永柱+吴琼+沙伟

摘要：利用改良CTAB法提取10种金发藓科（Polytrichales）植物基因组DNA，利用RAPD和分子标记技术对其进行遗传多样性研究。结果表明，在供试材料中筛选到具有多态性的RAPD引物12个，这些RAPD引物共扩增出68条带，多态性带42条，多态性条带比率（PPB）为61.76%；采用UPGMA聚类分析，供试材料分为2大类群，细叶拟金发藓单独聚为1类，其余9种植物聚为1类。RAPD和分子标记技术可用于金发藓科植物系统学研究。

关键词：金发藓科；RAPD；系统学；遗传多样性

中图分类号：Q75文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0058-03

金发藓科（Polytrichales）为金发藓目中唯一的1个科，全世界共有19个属，其中，Eopolytrichum为1个化石属[1]。Schofield保守估计认为金发藓目大约有370种[2]，但新近判断认为，该目实际上的种数不超过200种[3]。对金发藓科一些属种的分类地位，不同学者有不同的认识[4-8]。吴鹏程等将穗发藓属的主要种类及拟仙鹤藓属和新金发藓属归并入小金发藓属；将金发藓属中孢蒴口部盖膜呈肉质的种划入拟金发藓属[9]。Zouhair等利用随机扩增引物对金发藓属6种植物进行RAPD分析，共获得166条多态性DNA片段，根据RAPD分子标记结果，将6种植物分为2大类群，即金发藓、拟金发藓和P.c.var.perigoniale为1类，桧叶金发藓、毛尖金发[LL]藓和P.strictum为1类，第1大类中金发藓与拟大金发藓之间的亲缘关系更近一些[10]。金发藓科的许多植物在经典分类学上分类地位不清，且一些分子标记的试验结果与经典分类学结论相悖，这为金发藓科系统学研究提供了更广阔的空间。本研究采用RAPD分析方法，对金发藓科10种藓类植物进行遗传聚类分析，以期为更好地研究藓类植物的分类地位奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为自然风干的标本及2012年采集的新鲜标本，材料种名、采集地等信息见表1。

1.2仪器及药品

1.2.1仪器美国产PE-9600型PCR仪；北京六一仪器厂产DY-3型电泳仪和DYCP-33A型水平板电泳槽；日本产7A0-0012型GeneSpecl、SANYO制冰机和NUALR-6382E型超低温冰箱；河北省黄骅航天仪器厂产DZKW-D型水浴锅；德国产高速冷冻离心机HERMLEZ323K；1mL和20、200、100μL微量加样器；UVPGDS-8000型紫外凝胶成像系统；Barnstead纯水仪；PHS-25型酸度计；北京赛多利斯天平有限公司产电子天平。

1.2.2药品Tris、HCl、EDTA、NaOH、溴化乙锭（EB）、乙酸钠、冰乙酸、TE、CTAB、NaCl、TBE、乙醇、氯仿、异戊醇、溴酚蓝、蔗糖、抗坏血酸钠、PVP和3%β-巯基乙醇等，均为分析纯（AR）；4种dNTP、TaqDNA聚合酶及A、B、C、D、H、Y组引物，均为上海生工生物工程股份有限公司产品；DGL2000Marker，为大连宝生物公司产品。

1.3试验方法

1.3.1DNA提纯、保存及检测采用改良CTAB法提取试材DNA；放入-20℃冰箱储存或放入4℃冰箱待用；利用核酸检测仪通过紫外吸收法对DNA样品进行定量分析和纯度检测，并用琼脂糖电泳检测DNA。

1.3.2RAPD扩增

1.3.2.1扩增反应体系RAPD扩增体系总体积为25μL，其中，10×buffer、25mmol/LMg2+、10mmol/LeachdNTP、25g/LTemplateDNA、5000U/mLTaqpolymerase和10mmol/LPrimer等组分体积分别为2.5、2.0、1.0、1.0、0.3、0.8μL，用无菌ddH2O补足。

1.3.2.2扩增反应程序94℃2min；94℃1min，36℃1min，72℃2min，43个循环；72℃5min，1个循环。

1.3.2.3RAPD反应体系的优化RAPD反应体系为25μL，扩增引物为A11。针对反应体系中模板DNA、dNTP、引物和Taq酶浓度等4个组分，L16（54）正交试验基础上进一步进行L9（43）正交设计（表2、表3），以寻求最优方案。

1.3.4扩增产物的检测扩增结束，在反应混合物中加入5mL/L上样缓冲液，混匀；取15μL点入1.5%琼脂糖凝胶中，用0.5×TBE电泳缓冲液在3V/cm（84V）电场下电泳2～3h，经0.25mg/L溴化乙锭染色30min，在紫外凝胶成像系统下观察照相和分析。

1.3.5引物筛选正式扩增前，任意选取系统进化差异较大的2个不同品种DNA，以这2个品种均能扩增出清晰条带、重复性和多态性好的为引物选择依据，对上海生工生产的A、B、C、D、H、Y组共6组随机引物进行筛选。

1.3.6数据处理在筛选出的引物中，选取扩增清晰、稳定、重复性好的引物进行条带统计。电泳获得基因组扩增图谱的每1条带（DNA片段）均为1个分子标记，并代表引物的1个结合位点；根据各分子标记在相同电泳迁移率的有无，统计得到所有位点的二元矩阵，有DNA扩增带（显性）记为“1”，无带记为“0”，强带或可分辨的弱带赋值均为“1”；用NTSYS-PC软件处理RAPD数据，依据NEI-LI法计算各品种间的遗传相似度，按照类平均法（UPGMA）建立亲缘关系树状图。

2结果与分析

2.1RAPD反应体系优化

在L9（43）正交试验设计中，组合1、3扩增出2条带，组合2扩增出4条带，组合5扩增出1条带，其余组合未扩增出条带；组合2的多态性及清晰度最好，最佳RAPD扩增反应条件为反应总体积25μL、dNTP为0.4mmol/L、引物为0.4mmol/L、基因组DNA为15ng、Taq酶2.0U，其他成分为无菌ddH2O。

2.2引物筛选

利用优化反应体系对上海生工生物工程股份有限公司生产的A、B、C、D、H、Y组120条引物进行筛选，共筛选出12条多态性好的引物（表4），用于全部供试样品DNA的扩增。

2.3扩增结果

选用重复性和多态性较好、谱带清晰的12条引物对4属10种金发藓科植物样品进行RAPD扩增，结果由图1、图2、图3和表5可见，每个引物的扩增片段在2～9条之间；12个随机引物共获得68条谱带，即共检测到68个位点，平均每个引物检测到5.67个位点，其中，多态性条带为42条，多态百分率为61.76%。

2.4聚类分析

基于RAPD扩增结果，用UPGAM法进行聚类分析，得到供试材料相似性系数表和10种金发藓科植物系统学关系树状图。由表6和图4可见，10种金发藓科植物的遗传相似性系数在0.02～0.96之间，说明这10种植物亲缘关系较近；细叶拟金发藓与其他种遗传距离较远，自为1类，其余9种聚为1类；其他9种植物的遗传相似性系数在0.64处又可分2两类，即硬叶小金发藓和细疣小金发藓聚为1类，其余7种聚为

1类；这7种植物在遗传相似性系数0.78处又可聚为2类，即小仙鹤藓和小胞仙鹤藓聚为1类，台湾拟金发藓、拟金发藓、多形拟金发藓、毛尖金发藓和桧叶金发藓聚为1类。这说明10种金发藓科植物遗传相似性极高，与形态解剖学及其形态分类学地位表现出高度的一致性，这也与

参考文献：

[1]KonopkaAS，HerendeenPS，MerrillGL，etal.Sporophytesandgametophytesofpolytrichaceaefromthecampanian（latecretaceous）ofGeorgia，USA[J].InternationalJournalofPlantSciences，1997，158（4）：489-499.

[2]BuckWR.Introductiontobryology[J].Brittonia，1986，38（1）：94-95.

[3]HyvnenJ，HeddersonTA，MerrillGL，etal.Onphylogenyofthepolytrichales[J].TheBryologist，1998，101（4）：489-504.

[4]SmithGL.ConspectusofthegeneraofPolytrichaceae[M].NewYork：MemoirsoftheNewYorkBotanicalGarden，1971.

[5]AbolinAA.Polytrichumstrichum（Polytrichaceae）—anorginalspeciesofmordificantP.junipericum[J].BotZum，1983，70（10）：1503-1511.

[6]SchrieblA.CultureexperimentsonthemossgenusPolytrichum[J].JournalofHattoriBotanicalLaboratory，1982，53（2）：157-158.

[7]SmithMGL.NotesonasiaticPolytrichaceaeⅠ，Ⅱ[J].MemoirsoftheNewYork：BotanicalGarden，1987，45：419-425.

[8]SmithMGL.NotesonNorthAmericanPolytrichaceae：Polytrichastrum[J].TheBryologist，1992，95（3）：270-273.

[9]吴鹏程，贾渝.中国苔藓志：第八卷[M].北京：科学出版社，2004.

[10]ZouhairR，CorradiniP，DefontaineA，etal.RAPDmarkersforgeneticdifferentiationofspecieswithinPolytrichum（Polytrichaceae，Musci）：apreliminarysurvey[J].Taxon，2000，49（2）：217-229.

[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物筛选

利用优化反应体系对上海生工生物工程股份有限公司生产的A、B、C、D、H、Y组120条引物进行筛选，共筛选出12条多态性好的引物（表4），用于全部供试样品DNA的扩增。

2.3扩增结果

选用重复性和多态性较好、谱带清晰的12条引物对4属10种金发藓科植物样品进行RAPD扩增，结果由图1、图2、图3和表5可见，每个引物的扩增片段在2～9条之间；12个随机引物共获得68条谱带，即共检测到68个位点，平均每个引物检测到5.67个位点，其中，多态性条带为42条，多态百分率为61.76%。

2.4聚类分析

基于RAPD扩增结果，用UPGAM法进行聚类分析，得到供试材料相似性系数表和10种金发藓科植物系统学关系树状图。由表6和图4可见，10种金发藓科植物的遗传相似性系数在0.02～0.96之间，说明这10种植物亲缘关系较近；细叶拟金发藓与其他种遗传距离较远，自为1类，其余9种聚为1类；其他9种植物的遗传相似性系数在0.64处又可分2两类，即硬叶小金发藓和细疣小金发藓聚为1类，其余7种聚为

1类；这7种植物在遗传相似性系数0.78处又可聚为2类，即小仙鹤藓和小胞仙鹤藓聚为1类，台湾拟金发藓、拟金发藓、多形拟金发藓、毛尖金发藓和桧叶金发藓聚为1类。这说明10种金发藓科植物遗传相似性极高，与形态解剖学及其形态分类学地位表现出高度的一致性，这也与

参考文献：

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[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物筛选

利用优化反应体系对上海生工生物工程股份有限公司生产的A、B、C、D、H、Y组120条引物进行筛选，共筛选出12条多态性好的引物（表4），用于全部供试样品DNA的扩增。

2.3扩增结果

选用重复性和多态性较好、谱带清晰的12条引物对4属10种金发藓科植物样品进行RAPD扩增，结果由图1、图2、图3和表5可见，每个引物的扩增片段在2～9条之间；12个随机引物共获得68条谱带，即共检测到68个位点，平均每个引物检测到5.67个位点，其中，多态性条带为42条，多态百分率为61.76%。

2.4聚类分析

基于RAPD扩增结果，用UPGAM法进行聚类分析，得到供试材料相似性系数表和10种金发藓科植物系统学关系树状图。由表6和图4可见，10种金发藓科植物的遗传相似性系数在0.02～0.96之间，说明这10种植物亲缘关系较近；细叶拟金发藓与其他种遗传距离较远，自为1类，其余9种聚为1类；其他9种植物的遗传相似性系数在0.64处又可分2两类，即硬叶小金发藓和细疣小金发藓聚为1类，其余7种聚为

1类；这7种植物在遗传相似性系数0.78处又可聚为2类，即小仙鹤藓和小胞仙鹤藓聚为1类，台湾拟金发藓、拟金发藓、多形拟金发藓、毛尖金发藓和桧叶金发藓聚为1类。这说明10种金发藓科植物遗传相似性极高，与形态解剖学及其形态分类学地位表现出高度的一致性，这也与

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[6]SchrieblA.CultureexperimentsonthemossgenusPolytrichum[J].JournalofHattoriBotanicalLaboratory，1982，53（2）：157-158.

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[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.