异育银鲫中科3号MSTN基因的克隆与序列分析

2015-01-15张颖李冰朱健蒋高中

江苏农业科学 2014年11期

张颖+李冰+朱健+蒋高中

摘要：采用同源克隆和末端快速扩增（rapidamplicationofcDNAends，RACE）方法分离克隆了异育银鲫（Allogyogeneticscruciancarp）中科3号肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因全长DNA，得到3394bp全长的DNA，包含3段外显子和2段内含子，其中2098bp的全长cDNA在NCBI数据库中进行序列比对后，确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73.5%～98.0%，与鲤鱼MSTN基因相似度最高（98.0%），不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT-PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明，MSTN基因在脑中含量最高，其次是肌、鳃、心、肠，在肝脏中含量最低。

关键词：异育银鲫；肌肉生长抑制素；同源法克隆；末端快速扩增法；序列分析；组织表达分析

中图分类号：S917.4；Q785文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0040-05

鲫鱼是我国重要的淡水经济养殖鱼类，异育银鲫（Allogyogeneticscruciancarp）中科3号是当前主要的鲫鱼养殖品种之一。该品种是中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室桂建芳研究员等技术人员利用银鲫的双重生殖方式，从高体型（D系）异育银鲫（♀）与平背型（A系）异育银鲫（♂）交配所产后代中选育出来，再经异精雌核培育而来的异育银鲫第3代新品种[1]。中科3号异育银鲫具有生长速度快、遗传性状稳定等优点[2-4]，作为经济鱼类，其肌肉的生长发育是重要的生长过程，受分子水平调控等多因素的影响[5]。

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）又称生长分化因子-8（growthdifferentiationfactor-8，GDF-8），属于转化生长因子-β（transfominggrowthfactor-β，TGF-β）超家族，是肌肉发育和生长的负调控因子[6]。该基因是McPherron等于1997年在小鼠骨骼肌的cDNA文库中发现的，试验表明，MSTN基因敲除后的小鼠会发生肌细胞的增生与肥大，从而导致骨骼肌大量增加的现象[6]；牛中MSTN基因的自然缺失与突变也已被发现，突变结果导致MSTN基因失活，肌肉增生[7-8]。

目前，已有不少关于MSTN基因克隆及作用机制的研究，包括哺乳类[9-11]、鸟类[12-14]动物，在鱼类的研究中，也有不少物种的MSTN基因被报道，包括斑马鱼（Daniorerio）[8，15]、虹鳟（Oncorhychusmykiss）[16]、大麻哈鱼（Salmosalar）[17]、莫桑比克罗非鱼（Oreochromismossambicus）[18]、斑点叉尾（Ictaluruspunctatus）[19]、石首鱼（Umbrinacirrosa）[20]、奥利亚罗非鱼（Oreochromisaureus）[21]、鳡鱼（Elopichthysbambusa）[22]、军曹鱼（Rachycentroncanadum）[23]、牙鲆（Paralichthysolivaceus）[24]、勒氏笛鲷（Lutjanusrussellii）[25]、黄颡鱼（Pelteobagrusefulvidraco）[26]、泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）[27]、真鲷（Chrysophrysmajor）[28]、鳙鱼（Aristichthysnobilis）[29]等。鱼类MSTN基因除在骨骼肌中表达外，还可在其他组织如脑、心脏、肾、肠、精巢、鳃、脾、眼、肝等中表达[22，30]，不同于哺乳动物和鸟类的表达谱[31-32]。试验表明，MSTN基因功能缺失可以导致斑马鱼肌肉数量和体积的增加[15]。MSTN通过内分泌、自分泌和旁分泌3种不同的作用途径发挥作用，可与成肌细胞膜上的受体结合而引起受体自身的磷酸化，启动一系列信号传导过程，最终抑制成肌细胞的增殖和分化[33]。MSTN作为肌肉生长发育相关的重要调控基因，其相关研究对了解鱼类肌肉生长机理有重要作用。本试验克隆了异育银鲫MSTN基因，并对其序列和组织表达进行了分析。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用异育银鲫中科3号质量约80g，购自扬州市江都区，取20尾于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心（江苏无锡）的育种实验室进行暂养，用于RNA及DNA的提取。基因提取、反转录等试剂盒均购自TaKaRa公司（大连）。

1.2试验方法

1.2.1总RNA、基因组DNA的提取和cDNA模板的制备取试验鱼骨骼肌、脑、肝等6个组织，按RNAisoplus试剂盒的方法提取总RNA，使用基因组DNA提取试剂盒从全血中提取基因组DNA，用1%琼脂糖电泳和分光光度计检测所提基因的质量和浓度。按反转录试剂盒要求进行反转录，反应后置于-20℃保存。

1.2.2MSTN基因克隆与序列分析根据鲤鱼（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）和斑马鱼（Daniorerio，AY323521.1）的MSTN基因设计3对引物MSTNF1、MSTNR1，MSTNF2、MSTNR2，MSTNF3、MSTNR3（表1），用于扩增MSTNcDNA核心片段。根据所得序列设计用于5′RACE和3′RACE的特异性引物：MSTN5outer、MSTN5inner，MSTN3outer、MSTN3inner（表1），分别按照5′RACE和3′RACE试剂盒进行2轮扩增的巢式PCR。由鲤鱼（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）MSTN基因全序列设计2对引物MSTNF4、MSTNR4，MSTNF5、MSTNR5（表1）扩增2个内含子。扩增产物均在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，胶回收后经连接、转化、扩大培养、酶切验证后，将阳性克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序。将所测序列登录NCBI进行BLAST分析；用DNAstar软件分析序列及开放阅读框，并对其分子量、等电点、氨基酸组成等进行分析；用MEGA5.0软件中的距离矩阵邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树。

1.2.3半定量RT-PCR检测取试验鱼骨骼肌、脑、肝、肠、心、鳃6个组织，提取总RNA，平衡起始浓度后，反转录成cDNA。根据拼接获得的MSTN全长cDNA序列，设计半定量RT-PCR引物MSTNF6、MSTNR6（表1）和内参β-actin（GenBank：AB039726.2）基因引物βF、βR[34]（表1），以各组织的反转录产物为模板，用以上2对引物进行扩增。产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测并拍照。

2结果与分析

2.1试验结果

将PCR产物测序后进行比对，得到了异育银鲫MSTN基因的完整DNA序列，包括416、360、454bp3段部分编码序列，5′和3′两端324、990bp序列，以及756、776bp2段内含子序列。经NCBI的BLAST序列比对，确认所得序列为鲫鱼的MSTN序列。

2.2结果分析

2.2.1MSTN基因序列、氨基酸组成及特征位点分析以异育银鲫骨骼肌cDNA为模板，经PCR扩增、胶回收、克隆和测序，去除载体序列和重叠序列，拼接得到2098bp的全长cDNA，其中5′端扩增得到268bp，5′UTR为89bp；3′端扩增得到934bp，3′UTR为881bp，详见图1，可以看出，该cDNA包括典型的转录终止信号序列（AATAAA）和polyA尾。用DNASTAR软件预测可知，MSTN的分子量约为42.25ku，开放阅读框为1128bp，编码375个氨基酸，其中包含强碱性氨基酸（K、R）43个，强酸性氨基酸（D、E）47个，疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）116个，极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）105个，等电点为6.55。BLASTP分析发现，异育银鲫MSTN蛋白有2个典型的TGF-β蛋白结构域（图1），1个是TGF-β前肽结构域，从第37位到第256位，共220个氨基酸残基；另1个是TGF-β功能域，是TGF-β家族基因的活性区域，从第281位到第375位，共94个氨基酸残基。信号肽预测结果显示，N末端含有1个22个氨基酸组成的信号肽序列，切割位点位于22位的G和23位的D之间；碳端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基；异育银鲫MSTN蛋白也有典型的RXXR蛋白酶水解位点，为RARR（第263-266位）；起始密码子为ATG，终止密码子为TGA（图1）。总体看出，异育银鲫与其他物种的MSTN基因特征相同[22-24]。

2.2.2异育银鲫MSTN序列同源性与系统发育分析将异育银鲫MSTN与其他动物MSTN的ORF序列进行同源性比较，结果见表2。

用DNAMANVersion6.0软件，比较异育银鲫与人、小鼠、原鸡、斑点叉尾、斑马鱼、大马哈鱼、大西洋鲑、虹鳟、鲢鱼、鲤和牙鲆的MSTN氨基酸同源性。结果显示，异育银鲫与上述物种的序列同源性分别为75.0%、73.5%、75.0%、88.1%、89.9%、91.3%、75.4%、76.9%、97.0%、98.0%、79.8%，异育银鲫MSTN与鲤鱼MSTN的遗传距离最小，仅为0.020。

基于异育银鲫MSTN氨基酸序列和公布的其他物种的相应序列，用MEGA5.0构建了脊椎动物MSTN的分子进化树（图2）。结果表明，整个进化树分为2大分支，其中1支由人、哺乳类和禽类组成，另1支由鱼类组成；异育银鲫与鲤关系最近，与鲤鱼、斑马鱼、鲢鱼、斑点叉尾4种鲤形目鱼类在1个分支里。由进化树分析可知，所克隆到的MSTN基因属于Ⅰ型，物种MSTN系统发育与物种间的亲缘关系一致。

2.2.3异育银鲫MSTN基因组织表达分析采用半定量RT-PCR方法检测了MSTN基因mRNA在异育银鲫鳃、心、肠、肝、脑、肌肉6个组织中的表达情况，图3显示，异育银鲫不同组织均有1条70bp大小相同的条带，条带亮度具有组织差异性，在脑中表达量最高，在肌肉和鳃中表达量次之。以β-肌动蛋白基因为对照，进行了以上组织的RT-PCR检测，在所检测的组织样品中均得到β-肌动蛋白基因的特意扩增条带，说明不同组织中RNA的提取和反转录过程正常，模板cDNA完整，推测不同组织中检测到的MSTN转录子存在的差异是各组织MSTN表达情况的自然表现。

3讨论与结论

本研究采用分子克隆技术得到了异育银鲫中科3号MSTN基因的基因组DNA序列全长，并通过半定量RT-PCR方法检测了MSTN基因mRNA在异育银鲫鳃、心、肠、肝、脑、肌肉6个组织中的表达情况。MSTN作为胞外信号分子，可与成肌细胞膜上的受体结合而引起受体自身的磷酸化，从而启动细胞内一系列信号传导过程，作用于生肌决定因子（MyoD）靶基因的调控区，调节肌肉组成蛋白和蛋白基因的表达。MSTN的生物学功能主要为抑制成肌细胞增殖和分化，其中抑制增殖是通过调控细胞周期进程来实现的，MSTN通过抑制生肌决定因子（MyoD、Myf5、MyoG）和P21的表达来可逆地抑制成肌细胞的分化。MSTN的信号传导途径是MSTN-ActRⅡB型受体（蛋白激酶受体）-Smad蛋白信号传导通路，并通过内分泌、自分泌和旁分泌3种不同的途径发挥作用[33]。

根据ClustalX2.0.11软件对于异育银鲫MSTN氨基酸序列进行的同源性比较结果以及利用MEGA5.0软件的NJ方法构建的分子进化树表明，异育银鲫MSTN氨基酸序列与其他物种的相似度在73.5%～98.0%之间，符合鱼类的分类地位和亲缘关系，异育银鲫MSTN基因的氨基酸与鲤鱼的氨基酸相似度最高，其次是斑马鱼和鲢鱼，它们同属于鲤形目鲤科，亲缘关系最近；大马哈鱼、虹鳟和大西洋鲑隶属于鲑形目，因此与异育银鲫的亲缘关系较远；原鸡属于鸟类，小鼠和人属于哺乳纲，因此亲缘关系最远。研究发现MSTN基因在鱼类中存在2个异构体；在斑马鱼、大西洋鲑、大马哈鱼、虹鳟和鲤鱼中都发现了2种MSTN，根据与其他物种的MSTN基因序列及氨基酸序列比较分析，本研究得到的异育银鲫MSTN基因与其他物种的MSTN-1同源性较高，推测所克隆的为异育银鲫MSTN-1基因，是否存在MSTN-2则需进一步探究。

采用半定量RT-PCR技术对异育银鲫鳃、心、肝、肠、脑、肌6个组织中MSTN的表达量进行检测，结果在上述6个组织均有表达，根据条带的明暗程度推断，MSTN在上述组织中的表达水平依次为脑>肌≈鳃>心>肠>肝，与其他物种MSTN表达谱不同。MSTN在哺乳动物中主要表达于骨骼肌中，小鼠MSTN基因只在骨骼肌中表达[6]；在猪中，MSTN基因除了在骨骼肌中表达外，在乳腺中也有表达[35]；有研究表明，MSTN基因还在藏系绵羊真胃、瘤胃中表达[36]。与哺乳动物相比，MSTN基因在鱼类中的表达更广泛，可以在脑、心、肠、鳃、肾、眼睛、脾、性腺等多个组织中表达，但在不同鱼类中表达情况也不一样。该基因在鳡的肌肉、脑和心脏中均有表达[22]；而在鲤鱼中MSTN仅在肌肉和脑组织中检测到，在其他组织如心脏、精巢、眼睛和鳃中均未检测到[37]；在斑马鱼中，MSTN的表达谱也较广，在肝、心、胃、鳃、卵巢、精巢、肾、肌肉、眼、脑中均有表达[38]；在黄河裸裂尻鱼中，MSTN的表达在心脏、肝胰脏、肾、肌肉、脑、脂肪、肠、鳃和精巢共9个组织中均能检测到[30]。由此可见，MSTN基因的表达情况在鱼类中有较大差异，由MSTN在异育银鲫中的表达特征和表达水平分析可知，异育银鲫MSTN基因除调控肌肉生长发育外，还有可能参与心肌发育调控和代谢等其他功能。

MSTN是肌肉生长的负调控因子，异育银鲫MSTN基因的克隆为进一步研究异育银鲫肌肉生长分化与调节及其他鱼类该基因的克隆提供了依据，并为进行分子育种和其他应用创造了条件，人工控制MSTN的活性成为养殖业的一大课题。进一步可以有以下研究方向：利用分子标记技术选育肉质性状优良的鱼类；利用基因敲除技术获得MSTN缺失鱼类；利用RNAi技术干扰MSTNmRNA的表达筛选MSTN基因的抗体，开发饲料添加剂[38]。本试验将继续研究2代异育银鲫MSTN基因的单核苷酸多态性（SNPs）并进行比较。在动物育种方面，SNPs作为一种分子标记辅助育种强有力的工具也得到了广泛的应用，研究中会将SNPs与2个品种异育银鲫体型及体质量增长进行相关性分析，以期为异育银鲫分子标记辅助育种提供一定依据，确定有效的育种方案，并运用到生产实践中，为养殖品种的选择提供一定的依据。

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