苏云金芽孢杆菌原生质体的制备及大质粒转化

2015-01-15韩光杰孙俊李传明刘琴徐健

江苏农业科学 2014年11期

韩光杰+孙俊+李传明+刘琴+徐健

摘要：研究苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步提高原生质体转化率打下基础。通过酶解法对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种工业生产菌株（Bacillusthuringiensisssp.kurstaki）2671原生质体的制备及再生条件进行了研究，考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间等影响因素，采用PEG法对大质粒进行原生质转化。结果表明，对数生长前期的菌体（培养3h），以SMML作渗透压稳定剂，溶菌酶浓度7mg/mL，40℃下酶解40min，原生质体生成量可达5.7×107个/mL，再生率可达14.1%。在此条件下，采用PEG法可将大质粒pLTV1-ep成功转化宿主菌，转化率为0.3CFU/μg。

关键词：苏云金芽孢杆菌；原生质体；制备；转化

中图分类号：S482.3+9文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0037-03

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是使用最为广泛的生物农药[1]。目前，已经从Bt的不同亚种中分离了超过100种杀虫晶体蛋白[2-3]，但每个亚种的致病力又极其有限。插入外源基因构建工程菌是提高其杀虫效果的有效方法之一。Bourgouin等将球形芽孢杆菌的毒素基因成功转入Bt并表达[4]。Barboza-Corona等将几丁质酶基因导入Bt中，并分析了工程菌孢子及杀虫晶体的形成情况[5]。

目前，工程菌的构建主要采用原生质体转化和电转化。Yu等通过电转化将cyt1Aa和cry11Aa导入Bt中产生工程菌TnX，并将Bt菌株S184-Tet与TnX进行原生质融合，形成了新的重组菌TnY[6]。Akamatsu等利用原生质体转化将质粒pC194、pUB110、pCB1、pAC32R2成功导入枯草芽孢杆菌[7]。然而在构建Bt工程菌时多采用电转化[8-10]，对原生质体转化的研究则相对较少，与电转化相比，原生质体转化相对温和，不需转化设备，获得阳性转化子的概率较大，在试验条件不足、感受态形成受阻或大质粒转化时，原生质转化显得尤其重要。

不同Bt菌株的理化性质、毒素基因的遗传定位都不尽相同[11]，这就决定了每个菌株的原生质形成条件是不同的。研究表明，菌龄、溶菌酶的浓度、处理时间等对原生质体的形成有很大影响[12]，原生质体的形成率与再生率也影响着原生质转化效率[13]。本研究通过对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种原生质体形成的影响因素、再生率及大质粒原生质转化的分析，建立起一套完整的原生质体转化方法，为基因工程改良奠定了技术基础，也为不同菌株原生质转化提供了一种模式。

1材料与方法

1.1菌株和质粒

苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（B.thuringiensisssp.kurstaki2671）为实验室野外分离菌株，具有高效杀虫活性，已工业化生产。质粒pLTV1-ep为笔者所在实验室构建含增效蛋白基因的Tn917转座子载体，其大小为23.3kb。

1.2试剂及培养基

溶菌酶购于碧云天生物公司，PEG6000购于上海生工。2×SMM：0.1mol/L顺丁烯二酸，0.5mol/L蔗糖，0.02mol/LMgCl2·6H2O。SMML：由2×SMM和4×LB等体积混合而成。

DM3再生培养基：每100mL含1.6g琼脂粉，50mL1mol/L琥珀酸钠（pH值7.3），2g酪蛋白氨基酸水解物，1g酵母膏，0.7gK2HPO4、0.3gKH2PO4、0.234gNaCl、3mL20%葡萄糖、500μL2%牛血清白蛋白。

1.3原生质体的制备和再生

参考Bianca等的方法[12，14]，并进行优化。从新鲜平板上挑一单菌落，接种于5mLLB培养基中，30℃、250r/min培养过夜后以1%接种量转接到新鲜的25mLLB培养基中，振荡培养3h。离心收集菌体，用4mLSMML重悬，加200mg/mL溶菌酶至终浓度为7mg/mL，40℃、100r/min培养50min至85%的细胞变为原生质体。将原生质体离心去掉酶液，悬于SMML中，经稀释后涂布于DM3再生培养基上，培养2～3d，计算原生质体的形成率及再生率。计算方法为：

形成率=（A-B）/A×100%；

再生率=（C-B）/（A-B）×100%。

式中：A、B分别为溶菌酶处理前后在LB培养基上的菌落数；C为溶菌酶处理后在高渗培养基上的菌落数。

1.4原生质体的转化

根据Chang等的方法进行优化[15]。培养2d后，计算转化率。

1.5转化子的检测

挑取抗性平板的单菌落，接种于红霉素（15μg/mL）抗性LB培养基中，30℃、250r/min培养过夜后，提取质粒，PCR检测。

2结果与分析

2.1菌体生长状态对原生质体形成的影响

细胞的菌体生长状态是决定苏云金芽孢杆菌原生质体形成的重要因素。在转接培养时，分别取对数前、中、后、稳定期的菌体制备原生质体，研究菌体生长状态对原生质体形成的影响，使用5mg/mL的溶菌酶处理菌体，42℃水浴1h后镜检。从图1中可以发现，对数早期，转接培养3h的菌体能形成大量的原生质体，培养4h后原生质体形成减少，且有很多杆状菌体存在。随着培养时间的延长，原生质体的形成量逐渐降低，对数后期和稳定期基本不形成原生质。

2.2溶菌酶浓度对原生质体形成的影响

收集培养至对数前期3h的菌体，用SMML重悬，分别以1、2、3、4、5、6、7、8、9mg/mL9个不同浓度的溶菌酶在42℃，100r/min下酶解1h，结果见图2。原生质体形成时酶浓度对其有极大影响。当溶菌酶浓度为1mg/mL时，原生质体的形成率最小，为53.1%；随着溶菌酶浓度的提高，原生质体形成率越来越大，当溶菌酶浓度为9mg/mL时，原生质体的形成率达到95%，但溶菌酶浓度越高，原生质体形成率就越低。原生质体形成率达到85%以上基本能满足试验要求，此时溶菌酶浓度为7mg/mL。

2.3酶解温度对原生质体形成的影响

温度对酶解作用有双重影响，温度升高，酶解作用加快，温度降低，酶解时间延长，原生质体被毒害作用增加。分别以32、35、37、40、42℃5个温度酶解1h进行试验，结果见图3。随着温度升高，原生质体的形成率变大，42℃酶解1h，原生质体形成率能达到94.4%，但原生质体的形成量很低。在40℃时，原生质体的生成量相对较高，形成率达到87.9%。

2.4酶解时间对原生质体形成的影响

溶菌酶对细菌的质膜会有一定的破坏，因此酶解时间的长短会严重影响原生质体的再生。将菌体分别酶解30、40、50、55、60min后稀释涂布再生培养基，结果见表1。酶解温度40℃时，随着酶解时间的增长，原生质体的形成率逐渐增大，原生质体的形成量在酶解50min时达到最大，为7.4×107CFU/mL，但原生质体再生率在酶解40min达到最大值，为14.1%，酶解60min后，原生质体基本上不能再生。

2.5原生质体的转化与检测

使用带有红霉素抗性的质粒pLTV1-ep转化B.thuringiensisssp.kurstaki2671，转化率为0.3CFU/μg。挑取阳性转化子，经菌落PCR扩增，结果有2.7kb左右大小的目的条带，与预期大小一致，表明得到的转化子为阳性（图4）。

3讨论

苏云金芽孢杆菌作为微生物杀虫剂，在中国被广泛应用，基因工程杀虫菌的研究为提高杀虫活性和杀虫谱提供了重要方向。前人在构建工程菌的时候多采用电转化。电转化理论上的转化效率较高，但质粒较大时就很难转化，且缓冲液配方的选择是形成感受态的关键因素。相关方面前人已有较多研究[9-10，16-18]，制作不同的电击缓冲液，并摸索了电击转化条件等影响因素，质粒pLTV1-ep均不能被转化。可能由于该质粒大于15kb，电击转化相对较难，且该菌株不易形成感受态。原生质体转化则从理论上来讲，所有菌株都应该可以被成功转化的，除非有限制修饰系统。然而在形成原生质体的时候，会受到各个因素的影响，比如菌体培养时间、溶菌酶浓度、酶解温度、酶解时间等。本研究从上述因素分析了B.thurtingiensisssp.kurstaki2671菌株原生质体的形成条件、再生率及转化。

苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，细胞壁较壁中肽聚糖层厚，原生质体较难制备。菌龄过大，细胞壁致密，对酶有抗性，原生质体形成较难；菌龄较小，制备的原生质体大小不均，量小且易破裂不易再生。本研究采用1%接种量培养3h后，获得稳定性好、形成率高的原生质体。相关文献报道，在培养时添加甘氨酸，可以直接形成原生质体，本研究按此方法，在转接时添加4%的甘氨酸培养4h后，形成了原生质体，但原生质体的形成量极低，且菌液黏稠，不适宜用于原生质转化。

不同的细菌还需要调整原生质体制备液各组分的含量和pH值。相关研究表明，增加马来酸的含量可以提高原生质体的形成率，本研究在使用含0.02mol/L马来酸的制备液时，原生质体很难形成，但含量增加到0.1mol/L时，原生质体形成就相当稳定。细胞酶解的pH值也随着酶和菌种的特性而定。韩璞等在pH值为8.0的溶液中制备了罗伊氏乳杆菌原生质体[19]；Boixet等在pH值7.0的溶液中制备保加利亚乳杆菌的原生质体[20]；莫静燕等在pH值6.5的溶液中制备了地衣芽孢杆菌的原生质体。本研究选用溶菌酶最适的pH值6.5的条件下制备了原生质体，研究结果表明，只有当菌龄很低的时候，才能形成原生质体，菌龄超过3h后，原生质体形成率就很低，可能由于菌龄增大，细胞壁厚度增加，不利于溶菌酶的作用。在后期的研究中发现，提高pH值至8.0时，原生质的形成不受菌龄的影响，但再生率下降。

本研究对B.thurtingiensisssp.kurstaki2671原生质体的研究主要集中在制备、再生方面，但原生质体最终目的是用于DNA转化。在质粒转化的研究中，主要参考Chang等的方法[15]，选用40%PEG6000介导，成功获得阳性转化子。在保证原生质体感受状态的条件下，原生质体的转化效率还与质粒的构型、选择标记相关。本研究在电转化无法进行的情况下，利用原生质体转化成功获得阳性转化子，但转化效率还很低，原生质体的形成和转化还有待继续优化。

参考文献：

[1]ShaoZZ，YuZ.EnhancedexpressionofinsecticidalcrystalproteinsinwildBacillusthuringiensisstrainsbyaheterogeneousproteinP20[J].CurrentMicrobiology，2004，48（5）：321-326.

[2]SchnepfE，CrickmoreN，VanRJ，etal.Bacillusthuringiensisanditspesticidalproteins[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews，1998，62：775-806.

[3]CrickmoreN，ZeiglerDR，FeitelsonJ，etal.RevisionofthenomenclaturefortheBacillusthuringiensispesticidalcrystalproteins[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews，1998，62（3）：807-813.

[4]BourgouinC，DelécluseA，delaTorreF，etal.TransferofthetoxinproteingenesofBacillussphaericusintoBacillusthuringiensissubsp.israelensisandtheirexpression[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1990，56（2）：340-344.

[5]Barboza-CoronaJE，Ortiz-RodríguezT，delaFuente-SalcidoN，etal.HyperproductionofchitinaseinfluencescrystaltoxinsynthesisandsporulationofBacillusthuringiensis[J].AntonievanLeeuwenhoek，2009，96（1）：31-42.

[6]YuJ，PangY，TangM，etal.Highlytoxicandbroad-spectruminsecticidalBacillusthuringiensisengineeredbyusingthetransposonTn917andprotoplastfusion[J].CurrentMicrobiology，2001，43（2）：112-119.

[7]AkamatsuT，TaguchiH.PlasmidtransformationofcompetentBacillussubtilisbylysedprotoplastDNA[J].JournalofBioscienceandBioengineering，2012，114（2）：138-143.

[8]KalmanS，KiehneKL，CooperN，etal.EnhancedproductionofinsecticidalproteinsinBacillusthuringiensisstrainscarryinganadditionalcrystalproteingeneintheirchromosomes[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1995，61（8）：3063-3068.

[9]李林，邵宗泽，喻子牛.电脉冲法转化苏云金芽孢杆菌BMB171的研究[J].微生物学通报，2000，27（5）：331-334.

[10]刘萍，夏立秋，胡胜标，等.外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达[J].微生物学报，2008，48（5）：661-666.

[11]FischerHM，LüthyP，SchweitzerS.IntroductionofplasmidpC194intoBacillusthuringiensisbyprotoplasttransformationandplasmidtransfer[J].ArchivesofMicrobiology，1984，139（2/3）：213-217.

[12]莫静燕，陈献忠，王正祥.地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究[J].生物技术，2009，19（5）：75-77.

[13]张义正，刘白玲，何先祺.影响枯草杆菌原生质体转化的因素[J].微生物学通报，1997，24（4）：210-213.

[14]WaschkauB，WaldeckJ，WielandS，etal.GenerationofreadilytransformableBacilluslicheniformismutants[J].AppliedMicrobio-logyandBiotechnology，2008，78（1）：181-188.

[15]ChangS，CohenSN.HighfrequencytransformationofBacillussubtilisprotoplastsbyplasmidDNA[J].Molecular&GeneralGenetics，1979，168（1）：111-115.

[16]唐雪明，邵蔚蓝，王正祥，等.地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成及高效电转化[J].生物技术，2002，12（4）：13-15.

[17]LuYP，ZhangC，LvFX，etal.Studyontheelectro-transformationconditionsofimprovingtransformationefficiencyforBacillussubtilis[J].LettersinAppliedMicrobiology，2012，55（1）：9-14.

[18]YangMM，ZhangWW，BaiXT，etal.ElectroporationisafeasiblemethodtointroducecircularizedorlinearizedDNAintoB.subtilischromosome[J].MolecularBiologyReports，2010，37（5）：2207-2213.

[19]韩璞，田洪涛，苑社强，等.罗伊氏乳杆菌原生质体的制备与再生条件的研究[J].中国食品学报，2010，10（1）：10-18.

[20]BoizetB，FlickingerJL，ChassyBM.TransfectionofLactobacillusbulgaricusprotoplastsbybacteriophageDNA[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1988，54（12）：3014-3018.