基于ITS2 条形码序列对新型“香料”毒品植物成分的研究
2015-01-13杨雪莹曹海丹
杨雪莹,曹海丹,裴 黎,徐 鹏
(1.公安部物证鉴定中心 法医遗传学公安部重点实验室,北京100038;2.长春理工大学,长春 130022)
近期在世界很多国家和地区出现一种新兴毒品,形态与茶叶相似,吸食方法与大麻(Cannabis sativa)相同,燃烧会挥发出类似四氢大麻酚的物质(THC),其主要成分是JWH-073(1-丁基-3-(1-萘甲酰基)吲哚)和JWH-018(1-戊基-3-(1-萘甲酰基)吲哚)的一种烷基同系物。这两种化合物均为合成大麻素,能够与大麻素类似的受体结合,产生的效力比天然大麻强4~10 倍,能够迅速地从肺部转移到血液,到达全身各器官,吸食者可出现呕吐、妄想、精神恍惚和情绪失控等症状,严重者会感到呼吸困难、心跳加速、激动和瞳孔放大等。这种毒品由多种植物混合制成,吸毒者把它称作“香料”[1-3]。本研究使用DNA 条形码鉴定技术,采用ITS2 DNA 条形码片段,对新型“香料”毒品的植物成分进行鉴定研究,为“香料”毒品中有效成分的分析提供更确切的信息。
1 材料与方法
1.1 材 料
材料为某市查获的疑似毒品物质,查获的部分样品外包装袋上标识为“spike 99”,“K2”,“7 号”。样品均为干燥植物成份,“K2”取两种不同颜色样本各1 份(“K2”-1, “K2”-2)、“spike 99”、“7 号”各取1 份,每种样本各取30mg,研磨成粉末,利用QIAGEN DNeasy plant mini kit 提取基因组DNA。
1.2 PCR 扩增及序列测定
采用正向引物5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3',反向引物5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'扩增ITS2 片段。PCR 反应总体积为25μL,体系内含PCR mix 12.5μL(Tiangen Biotech Co., 中国)、引物各1μL(2.5μmol/L),总DNA 1μL。PCR 反应程序为94℃,预变性5min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 45s,40 个循环;72℃延伸10min。纯化PCR 产物并使用ABI公司的3730XL 测序仪(美国Applied Biosystems公司)进行双向测序[4-5]。
1.3 序列分析
将测序得到的峰图应用CodonCode Aligner V3.71(美国CodonCode 公司Dedham, MA)序列分析软件进行校正拼接,ITS2 序列用HMMer 注释法切除5.8S 和26S 端,保留ITS2 的全长,应用BLAST方法在NCBI 数据库中比对。
2 结果与分析
以植物样本基因组DNA 为模板,扩增ITS2 基因片段得到了清晰的PCR 产物,空白对照无条带,见图1。
图 1 测试样品PCR 产物电泳图。M:2000bp 分子量标准品;1-4 依次为“spike 99”、“K2”-1、“K2”-2、“7 号”PCR产物。Fig.1 Amplification of ITS2 from 4 samples. M: 2000bp molecular marker; Lane 1-4: “spike 99”,“K2”-1,“K2”-2,“7#”.
将PCR 产物纯化后经3730XL 测序仪进行测序,将序列用HMMer 注释法切除5.8 和26S 端,保留ITS2 的全长,最终得到5 条220~235bp 的序列。经BLAST 比对,同源性分析,发现所检测的样本“K2”-1 ITS2 片段序列与啤酒花(Humuluslupulus)ITS2 序列的同源性高达100%(见图2),“K2” -2 ITS2 片段序列与黄蜀葵(Abelmoschusmanihot)ITS2序列的同源性高达100%,“7 号” ITS2 片段序列与大麻(Cannabis sativa) ITS2 序列的同源性高达100%,“spike 99”ITS2 片段序列与紫花苜蓿(Medicago sativa)ITS2 序列的同源性高达100%。
图2 “K2”-1 ITS2 比对结果Fig.2 Sequence alignment of “k2”-1 with ITS2 sequences in NCBI database
3 讨 论
DNA 条形码技术是一种新兴的物种鉴定方法,因其操作简单、通用性强、技术统一,近年来逐渐成为物种鉴定研究的热门方法[6]。ITS2 序列是位于核基因的一小段序列, 该序列在绿色植物中分布广泛, ITS2 具有序列短、容易扩增、鉴定能力强等多个DNA 条形码应有的优点, 是植物的DNA 条形码研究中最受关注的序列之一[4]。
本研究基于ITS2 条形码序列针对案件中缴获的“spike 99”、“K2”、“7 号”物质中的植物成分进行DNA 提取,通过PCR 扩增,获得了高纯度的ITS2 基因片段,在Gen-Bank 通过BLAST 搜索、比对,确定“spike 99”中植物成分与紫花苜蓿ITS2 基因序列的部分片段的同源性高达100%;“K2”中检出两种植物成分分别与啤酒花、黄蜀葵的同源性为100%,“7 号”与大麻的同源性为100%。其中黄蜀葵与大麻外形相似,为毒品原植物大麻的易混淆品种,但它与紫花苜蓿、啤酒花均是有经济实用价值和药用价值的植物, 均不含有毒成分。针对本案例中缴获的“spike 99”、“K2” 、“7 号”物质中的化学成分应用GC-MS 方法分析结果显示,“K2”的主要活性成分是JWH-018, “spike 99” 主要的活性成分是JWH-073 和JWH-018,“7 号”的主要活性成分是大麻[7,8]。综上所述,在本研究中,“spike 99”、“K2”中未检出天然大麻成分,为非毒品原植物添加入人工合成大麻素成分制成的新型毒品,这与化学成分分析结果一致。由于研究样本量有限,而且形态不规则,应用传统形态学很难确定其植物成分,DNA 条形码技术因此成为植物形态学分类的有效补充,可为物种鉴定提供更准确的信息,相信随着该技术的日益成熟,将会成为各类案件中的未知植物样本鉴定的有效手段。
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