芸薹属油菜种间与亚种间杂交亲和性研究

陈纪鹏，熊桃园

(宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春，336000)

油菜属于十字花科芸薹属，它是我国重要的油料作物，有着重要的经济价值。其栽培品种包括3种:白菜型油菜(Brassica rapa AA，2n=20)、芥菜型油菜(B. juncea AABB，2n =36)、甘蓝型油菜(B. napus AACC，2n =38)。白菜型油菜在我国分布范围广，具有分枝多且分枝部位低、抗寒、耐瘠、生育期短等特征。芥菜型油菜的优良性状很多，其中有大多优点是甘蓝型油菜所不具备的，例如:黄籽、抗病虫、抗倒伏、抗裂角、耐旱、耐瘠薄、含油量高等。［1］白菜型油菜的不同品种间性状具有一定的差异，但是同属白菜型油菜的不同品种和亚种间亲缘关系较近;而芥型油菜与甘蓝型油菜之间属于不同种之间的杂交。白菜型油菜与芸薹属其它种间的杂交可以创造出多种多样的杂种后代，形成丰富的种质资源。杂交亲和性是研究较多的一个方面，例如白菜型油菜与芥菜型油菜杂交的亲和指数为0.037 和0.113，正反交亲和性相差很大，以芥菜型油菜为母本时亲和性较好。［2］白菜型油菜与菜型油菜油菜间的杂交也用于拓展白菜型油菜的遗传资源，杂种一代通过与白菜型油菜较续回交创造渗入系成功将菜型油菜的一些性引入白菜型油菜。［3］白菜型油菜常与甘蓝杂交用于合成新型油菜甘蓝型油菜。［4，5］白菜型油菜具有多个亚种和变种，它们之间杂交可以产生性状优良的杂种后代。不同白菜型油菜品种和自交系间的杂交有些组合表现为超亲优势，但有组合去表现为负超亲优势。［1］因此，研究油菜种内和种间杂交对利用丰富的白菜型油菜资源意义重大。本研究进行了矮壮青和黄秧白，芥菜型油菜与甘蓝型油菜之间杂交，研究种间和亚种间杂交的亲和性以及杂种后代的遗传特征，分析二者之间存在的差异。并且分析各个组合杂种后代的杂种优势、优良性状，创造有经济价值的新种质。

1 材料和方法

1.1 材料

选用两个白菜型油菜亚种‘矮壮青’和‘黄秧白’进行亚种间杂交，芥菜型油菜‘雪里蕻’和甘蓝型油菜品种‘中油821’进行种间杂交。于10 月上旬在宜春学院实验田播种，为了使父母本花期相遇，甘蓝型油菜适当晚播。当地油菜生长季节气候温暖湿润，适合油菜生长。

1.2 方法

1.2.1 杂交方法 矮壮青和黄秧白之间的正反交组合以及以芥菜型油菜为母本甘蓝型油菜为父本的杂交，对母本进行人工剥蕾，严格去雄后套袋隔离，并挂牌注明去雄时间、杂交组合名称。于第二天早晨再进行人工授粉，最后套袋处理以防止串粉，7d 后去掉纸袋。授粉后15d 后，取膨大的角果进行胚培养。成熟时按组合分别收获种子。

1.2.2 杂交亲和性观察 将芥菜型油菜严格去雄后套袋，第二天早晨收集新鲜的甘蓝型油菜的花粉，将其轻轻涂抹于去雄后的母本雌蕊柱头，最后套袋。分别于4、8、12、16h 后各摘取5 枚母本雌蕊，用卡诺液固定1h，保存在70%酒精中。接着于8mol/L NaOH 溶液中浸泡12h，再用蒸馏水反复冲洗，然后在0.1%苯胺蓝溶液中染色24h。最后将染色的雌蕊放于载玻片压片，放于显微镜下观察花粉管的萌发及伸长情况并用装有CCD 的荧光显微镜拍照。

1.2.3 胚培养 在芥菜型油菜与甘蓝型油菜杂交中，人工授粉后15－20d，摘取膨起的角果于烧杯内，用75%浓度的酒精和0.1%浓度的升汞溶液先后进行2min、15min 的浸泡消毒，消毒后取出角果，再用无菌水漂洗3 次。对所需的实验操作物品进行消毒，最后在无菌实验操作台上，用镊子剥取出角果内部幼胚移置于MS 培养基的表面上，操作完毕后将置于27℃、12h 光照12h 黑暗的光周期条件下的培养箱里面进行培养。幼胚出芽时，将芽转移到MS+0.25mg/L NAA+1.5mg/L 6－BA 的培养基中增殖培养。

1.2.4 杂种后代性状观察 将矮壮青和黄秧白正反交，芥菜型油菜和甘蓝型油菜杂交得到的杂种在符合油菜播种气候的时期种在土壤中，精心栽培并观察记录其各阶段的生长状况以及形态性状。

1.2.5 花粉育性观察 在油菜开放旺盛的时候，采摘杂种5 枚花朵。在载玻片上滴加1 ～2 滴醋酸洋红染色剂，用镊子镊取饱满的花药置于载玻片染色剂所在位置上，并用镊子压迫花药挤出花粉粒并除去花药壁。然后盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡呈饱满、圆形、大、被染色程度深的花粉是可育的，反之为不可育的。

2 结果与分析

2.1 胚培养情况

以芥菜型油菜为母本，甘蓝型油菜为父本进行人工杂交，在角果内生长出幼胚后进行该杂种的胚培养实验。将幼胚共25 个接种于MS 培养基，不加任何激素，蔗糖浓度3%。培养5d 左右，幼胚根开始伸长，并产生大量白色根毛。继续培养，只有18 个胚即72%的胚产生芽并长成幼苗。在培育幼胚生长成幼株的一段时间后移栽至土壤中，全部幼苗都能成活。

2.2 杂种后代形态特征观察

将黄秧白和矮壮青正反交和以芥菜型油菜为母本甘蓝型油菜为父本的杂交杂种种植于土壤后观察各个杂交组合杂种后代的形态特征(图1A、B、C)。矮壮青和黄秧白正反交杂种性状相似，很难从外形上辨别两者。两杂种的植株高度都处于两亲本之间，但是一级分枝数量超过了亲本，并且结实率也超过了亲本。分枝高度较低，表现为丛生。处于苗期阶段的正反交杂种对比，矮黄杂种性状更接近矮壮青，植株矮小，叶片颜色淡绿。而黄矮组合杂种其性状更接近黄秧白，植株稍高，叶片黄绿，前者叶片较后者大，抽薹后两杂种性状才变得相似几乎一样，表现在叶片大小、叶色、花期等方面。成熟期植株遗传性状如表1 表示，生长旺盛，分枝较多，角果数多，且结实正常。

图1 杂种形态学、花粉、花粉萌发情况

A:黄秧白;B:矮壮青×黄秧白;C:矮壮青;D:芥菜型油菜×甘蓝型油菜杂种;(标尺=10cm)E:芥菜型油菜×甘蓝型油菜杂种花(左:芥菜型油菜，中:杂种，右:甘蓝型油菜);F:芥菜型油菜×甘蓝型油菜杂种花的雌蕊和雄蕊;(标尺=1cm)G:矮壮青×黄秧白杂种花粉;H:芥菜型油菜×甘蓝型油菜杂种花粉;(标尺=50u)I:芥菜型油菜与甘蓝型油菜杂交花粉萌发。(标尺=1mm)

表1 杂种形态学特征

芥菜型油菜和甘蓝型油菜杂种种子颜色接近芥菜型油菜即红褐色，苗期阶段其性状更接近芥菜型油菜(图1D)，抽薹后植株高大超过亲本植株高度，枝条粗壮，一级分枝数目超过亲本，但是第一分枝高度低于亲。植株形态类似芥菜型油菜，植株高大(表1)。杂种叶片颜色接近甘蓝型油菜，叶型也与甘蓝型油菜相似，表面有蜡粉，叶片颜色深绿。花的形态介于双亲之间，大小接近芥菜型油菜(图1E)。雌蕊发育较好，但雄蕊发育较差，花药不能伸至柱头顶部(图1F)。大多数角果内仅有2－3 粒种子，而且多数种子不饱满。大量角果未形成种子，角果发育不良(表1)。

2.3 杂种花粉育性与自交结实率

根据各品种杂种结实数据可知，矮壮青和黄秧白正反交杂种其所结角果数目较多，几乎都是饱满的种子，而芥菜型油菜和甘蓝型油菜所结角果数目较少，不饱满的占大多数。另外通过花粉粒染色试验可知，黄秧白和矮壮青杂种的花粉育性为95%左右，反交组合的花粉育性也为95% 左右 (图1G)。芥菜型油菜和甘蓝型油菜杂种的花粉育性仅为33%左右(图1H)。

2.4 杂交亲和性的观察

以芥菜型油菜为母本，甘蓝型油菜为父本人工授粉后的4h，母本柱状上附着大量花粉，有35%以上的花粉出现萌发(图1I)。16h 后，花粉萌发率为95%左右，花粉管伸长并且能够伸长至胚珠。说明大部分父本花粉可以克服种间杂交的殖隔离完成雌雄配子的融合过程。授粉后7d 左右，角果部分籽粒开始膨大。成熟期平均每个角果可形成3－5粒饱满种子，同时还有大量的不饱满种子形成。饱满种子种植后部分能正常发芽，发芽率为50.5%。所得全部植株经鉴定全部为真杂种(表2)。

表2 杂交亲和性观察

3 结论与讨论

影响远缘杂交亲和性大小的因素有很多，其中环境因素是影响油菜远缘杂交亲和性大小的因素之一，［6］高温、长日照等环境条件能够促进受精作用，因此通常选在阳光充足温度高的时间段对母本进行人工去雄授粉。除此之外，很多实验研究证明，远缘杂交其后代得到的难易程度与亲本的亲缘关系密切相关，关系越近越容易得到后代，反之则越困难。［7］本实验进行了白菜型油菜种内杂交实验，即矮壮青和黄秧白之间的正反交，它们相对于本实验所做的油菜种间杂交实验，即芥菜型油菜和芥菜型油菜杂交组合，更容易得到杂种。以蔊菜为母本、甘蓝型油菜为父本进行杂交，直接人工去雄授粉出现两个花序开花结实，相反以甘蓝型油菜为母本、蔊菜为父本的杂交组合，授粉后的子房仅仅是膨大而已，并且在其生长过程中会停止生长。［8］白菜型油菜品种间虽然存在着一定的差异，但是本实验所进行的矮壮青与黄秧白正反交的实验，实验数据显示两个组合所得到的杂种其性状是有差异性却是很小的，其杂交方向并没有影响后代的亲和性。徐爱遐等［9］研究了甘蓝型油菜和芥菜型油菜种间杂交亲和性发现，两种材料正反交后得到的结果是不一样的。以芥菜型油菜为母本其它油菜为父本的杂交能够比较容易地得到杂种，相反，以其它油菜母本、芥菜型油菜为父本的杂交得到后代杂种却是比较困难的。［10］刚好与本实验的结果一致，即以芥菜型油菜为母本、甘蓝型油菜为父本杂交后较容易的得到了其杂种。大多数研究发现，当两亲本的染色体条数不一致时，一般而言，选择以染色体数目多的作为母本，染色体数目少的作为父本，这样的组合其后代杂种比反交更容易得到，有些反交组合甚至得不到杂种。［11，12］相反，芥菜型油菜染色体数目36 条，甘蓝型油菜染色体数目38 条，本实验以染色体少的芥菜型油菜作为母本染色体数目多的甘蓝型油菜作为父本，杂交后代比较容易得到。

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