HPLC-DAD 法同时检测镇静安神类中成药及保健食品中非法添加的药物

韩东岐， 鲁 艺， 殷 果， 王 珏， 胡伟慧， 梁莹莹， 王铁杰

(深圳市药品检验所，深圳药品质量标准研究重点实验室，广东深圳518057)

由于生活节奏不断加快，工作压力增加，身体已进入亚健康状态的人们会出现焦虑不安、失眠多梦等问题。随着经济条件的发展和科学技术的进步，人们更崇尚“绿色食品”，意识到巴比妥类、苯二氮卓类等化学安眠药物长期使用时，会产生不良反应甚至毒副作用。因此，不良反应相对较少的中成药(中药注射剂除外)更受到人们的青睐，其相关的保健食品也越来越受到欢迎。但是，一些利欲熏心的造假者在中成药及保健食品中非法添加该类化学药物，夸大产品功效来提高销售量，欺骗消费者，谋取不正当利益。这种违法行为不仅危害了消费者的身体健康，影响了中成药和保健食品的声誉，还严重阻碍了中医药事业的健康发展［1-3］。

由于含非法添加药物的中成药和保健食品种类多样、成分复杂，之前的检验标准及方法又相对滞后［4］，故易出现漏检误检的现象。与此同时，非法添加物化学成分的类型繁多，添加手段隐秘，现行标准无法完全覆盖。因此，欲实现全面有效地打击非法添加行为，需要从技术层面进行突破，建立一个可有效提高检测准确率的方法，从而节约时间，降低监管、检验部门与商家的成本［5］。

目前，国家食品药品监督管理局的药品检验补充方法和项目采用了三种色谱体系和两种提取方法，对镇静安神类中成药及改善睡眠类保健品中的非法添加物进行检测，但它们可同时检测到的化学成分较少，操作较繁琐，见表1。

表1 检验方法与项目Tab.1 Inspection methods and items

此外，近几年有关安神类中成药和保健食品非法添加的文献表明［6-18］，对于其检测方法的研究是远远不够的，见表2。

表2 2007 至2014 年有关非法添加化学成分的文献情况Tab.2 Literatures about illegally added chemical constituents from 2007 to 2014

在深圳市药品检验所数据库中，安眠类化学药物有20 多种，现已对其中17 种摸索出色谱条件，见表3。

表3 17 种化学药物的色谱条件Tab.3 Chromatographic conditions of 17 chemical drugs

本实验依靠深圳市药品检验所现有的仪器设备，选择数据库中尚未考察出色谱条件的氯氮卓、盐酸多塞平、盐酸氯丙嗪、盐酸羟嗪、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、苯妥英钠、司可巴比妥钠这9 种安眠药物进行研究。虽然目前已有相关报道，但检测方法大多涉及到质谱等手段［9-11，15］，对仪器性能要求高，不利于基层药检机构进行快速检测工作，而且能同时检测到的化学成分较少。本实验运用了高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)法，建立了同时检测镇静安神类中成药及保健食品的片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂和口服液体制剂中非法添加上述9 种安眠药物的方法，并应用于147 批样品，结果发现多批样品中非法添加了这些药物。因此，该方法可更快速、简便地检测出非法添加物，为更好地打击不法行为提供可靠的技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Alliance HPLC 色谱仪，包括分离单元 (e2695)、二极管阵列检测器 (2998)、Waters Empower 色谱工作站(美国Waters 公司);XS105DU 电子天平(万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司)。

1.2 试药 氯氮卓(批号171248-200301)、盐酸多塞平(批号100069-201103)、苯妥英钠(批号100210-201002)、司可巴比妥钠 (批号171223-200402)、盐酸羟嗪(批号100266-200201)、劳拉西泮(批号171253-201102)、盐酸氯丙嗪(批号100460-2005-1)、 艾 司 唑 仑 (批 号 171219-201003)、阿普唑仑(批号171218-200603)对照品均购自中国食品药品检定研究院。

147 批镇静安神类中成药及保健食品(中成药87 批，保健食品60 批)一部分为药监部门市场监管抽样，其他均为市售样品;养血安神片(国药准字号Z14020533，批号20120701)购自山西旺龙药业有限公司，按临床推荐口服用量加入上述9 种对照药品，作为模拟阳性样品。

甲醇为色谱纯(美国Tedia 公司);磷酸、三乙胺、磷酸二氢铵均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);水为超纯水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-Aq 色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);甲醇为流动相A，含0.1%三乙胺的0.05 mol/L 磷酸二氢铵水溶液(用磷酸调节pH 至2.54)为流动相B，梯度洗脱，洗脱顺序见表3;检测波长210 (盐酸多塞平、盐酸羟嗪、苯妥英钠、司可巴比妥钠)、220 (阿普唑仑、艾司唑仑、劳拉西泮)、254 nm (氯氮卓、盐酸氯丙嗪)，DAD 全波长扫描(190 ～400 nm);体积流量1.0 mL/min;柱温(35 ±5)℃;进样量10 μL。

表4 梯度洗脱顺序Tab.4 Gradient elution sequence

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含盐酸多赛平、盐酸羟嗪、盐酸氯丙嗪和阿普唑仑0.05 mg、氯氮卓、劳拉西泮和艾司唑仑0.02 mg、苯妥英钠和司可巴比妥钠0.1 mg 的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液［12-13］

2.2.2.1 片剂 取样品1 片，研细(保留糖衣)，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声(120 W、40 kHz，下同)15 min，放冷，过滤，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.2.2 胶囊剂 取样品1 粒，连胶囊壳一同研细，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声15 min，放冷，过滤，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.2.3 颗粒剂 称取颗粒剂约0.25 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声15 min，放冷，过滤，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.2.4 丸剂 将丸剂研细，称取0.25 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声15 min，放冷，过滤，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.2.5 口服液体制剂 取样品一瓶，加入适量甲醇稀释至25 mL，过滤，取续滤液，过0.45 μm滤膜，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 按“2.2.1”项下方法配制各对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行分析，以各组分质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表5。

表5 9 种安眠药物的线性关系Tab.5 Linear relationships of nine hypnotic drugs

2.3.2 精密度试验 取混合对照品溶液适量，连续进样6 次，在“2.1”项色谱条件下测定峰面积及保留时间。结果，各药物峰面积RSD 均小于1.0%，保留时间RSD 在0.05% ～0.18%之间，表明仪器精密度较好，见表6。

表6 9 种安眠药物的精密度和稳定性Tab.6 Precisions and stabilities of nine hypnotic drugs

2.3.3 稳定性试验 取混合对照品溶液适量，于0、2、4、6、8、12、24 h 测定。结果表明，溶液在24 h 内基本稳定，见表6。

2.3.4 检出限与定量限 以信噪比(S/N)为3时的质量浓度为检出限(LOD)，S/N 为10 时的质量浓度为定量限(LOQ)，见表7。

表7 9 种安眠药物的检出限与定量限Tab.7 Detection and quantitative limits of nine hypnotic drugs

2.3.5 回收率试验 精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含盐酸多赛平、盐酸羟嗪、盐酸氯丙嗪和阿普唑仑1.5 mg，氯氮卓、劳拉西泮和艾司唑仑0.5 mg，苯妥英钠和司可巴比妥钠3 mg的混合对照品溶液。再取养血安神片(不含上述对照品)6 份，每份0.25 g，分别精密加入混合对照品溶液1、2、4 mL，置于50 mL 量瓶中，精密加入甲醇适量，定容，计算回收率(n =2)，结果见表8。由表可知，各对照品回收率均在90%以上，其RSD 值符合要求，能满足检测需要。

2.3.6 专属性试验 取模拟阳性样品适量，按照上述方法提取，以相应试剂为空白对照。结果，模拟样品在与9 种对照品相同的保留时间处，均检测出光谱特征一致的色谱峰，说明该方法可有效排除天然药物组分的干扰，专属性良好，色谱图见图1。

2.4 样品的检测

2.4.1 检测结果 用本实验所建立的方法，分别对市场上147 批不同剂型的镇静安神类中成药及保健食品进行检测。结果，有11 批检出盐酸多塞平，3 批检出艾司唑仑，各有1 批检出劳拉西泮、阿普唑仑和氯氮卓。

2.4.2 添加成分定量测定 根据“2.4.1”项下结果，对阳性样品采用外标一点法进行添加成分含有量计算，并总结其添加量范围，以了解违法添加的程度，结果见表9。由表可知，目前不法分子均根据(甚至低于)化学药品的推荐口服剂量来制定非法添加剂量，并且通过减少每片添加剂量来增加服用片(粒)数，故难以检测。

表8 9 种安眠药物回收率试验结果Tab.8 Result of recovery tests of nine hypnotic drugs

图1 专属性试验HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of specificity test

3 讨论

3.1 测定方法的选择 目前人们对非法添加化学成分的鉴定方法有液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法和红外分光光度法等，但上述方法对仪器设备的要求较高，或者准确度和灵敏度较低。而高效液相色谱法有快速、简便及专属性良好的优点，同时又具有普适性，故本实验选用高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)法对样品进行检测，以便将其推广到更多药检机构等有关部门使用。

表9 阳性样品中非法添加的安眠药物及其添加量Tab.9 Illegally added hypnotic drugs and their quantities in positive samples

3.2 检测波长的选择 为了兼顾国家食品药品监督管理局的药品补充检验方法和项目“安神类中成药中非法添加化学品检测方法(编号2009024、2012004)”，本实验以甲醇为溶剂，在200 ～400 nm 波长范围内进行扫描。综合考虑，最终选择210 nm 为盐酸多塞平、苯妥英钠、司可巴比妥钠、盐酸羟嗪的检测波长;220 nm 为阿普唑仑、艾司唑仑、劳拉西泮的检测波长;254 nm 为氯氮卓、盐酸氯丙嗪的检测波长。

4 结论

本实验建立了HPLC-DAD 法来同时检测安神类中成药和保健食品中非法添加的9 种安眠药物，该方法快速简便，并考察了市场上147 批安神类中成药。结果显示，目前非法添加现象十分严重，而且不法分子往往会认真钻研药物的安全和推荐口服剂量，采用每片(粒)少量添加、推荐多服用的方式，既达到疗效显著的目的，又难以被检测出。因此，该方法可满足对非法添加化学成分的检测要求，使基层药检机构在打击安神类中成药和保健食品中非法添加的工作更加高效、简便，为政府提供了有力的技术支持。

［1］ 董永成，杜士明，陈永顺，等. 中成药及保健品非法添加化学成分的类型、危害及对策［J］. 时珍国医国药，2006，17(8):1601-1603.

［2］ 张吉花. 镇静催眠药滥用的原因与防治措施［J］. 现代医药卫生，2008，24(22):3461-3462.

［3］ 王丽霞，李 力，谢燕霞，等. 含化学(西药)成分中成药的安全使用［J］. 药学服务与研究，2002，2(4):211-214.

［4］ 谢志洁. 健康产品中非法添加化学成分快速筛查方法理论与实践［M］. 广州:华南理工大学出版社，2011:11.

［5］ 王铁杰，肖丽和，关潇滢，等. 中成药和保健食品中掺杂褪黑素的快速测定方法:中国，201110316788.3［P］.2012-03-28.

［6］ 倪 瓒，谢循策，刘 萌. HPLC 法测定保健食品中非法添加的12 种镇静安神类化学药物［J］. 中国卫生检验杂志，2014，24(17):2491-2493.

［7］ 黎雪清，谭 渺，蒋创杰，等. HPLC 法快速筛查抗风湿类中成药和保健食品中24 种非法添加化学成分［J］. 中成药，2014，36(9):1891-1894.

［8］ 林 芳，李 涛，李 继，等. UPLC-DAD 法快速测定改善睡眠类保健食品中违法添加的14 种精神药物［J］. 食品科学，2013，34(22):218-223.

［9］ 朱小红，马鹏飞，徐 翔. 气相色谱-质谱联用定性检测保健食品和中成药中非法添加的镇静催眠类药物［J］. 中国药业，2012，21(19):36-38.

［10］ 刘吉金，肖丽和，关潇滢，等. GC-MS 检测镇静安神类中成药及保健食品中添加化学成分的方法研究［J］. 药物分析杂志，2011，31(2):376-379.

［11］ 陈安珍，杨 钊，王尊文. UPLC-MS/MS 法检测镇静安神类中药制剂及保健品中添加的化学药品［J］. 中国药事，2010，24(4):383-386.

［12］ 葛文超，汤 慧，张 萍，等. 高效液相色谱法同时测定镇静安神类中成药及保健食品中非法添加5 种西药成分［J］. 安徽医药，2010，14(9):1018-1020.

［13］ 王怡君，孙苓苓，朱 莹. 安神类中成药中非法添加化学药成分检测方法研究［J］. 中国药事，2010，24(11):1074-1076.

［14］ 肖丽和，刘吉金，关潇滢. 镇静安神类中成药及保健食品中非法添加化学成分的快速筛查方法研究［J］. 中国当代医药，2009，16(14):15-16.

［15］ 祝 波，赵宗阁，王尊文，等. LC-MS/MS 法分析保健品及中成药中添加的15 种镇静催眠剂［J］. 药物分析杂志，2010，30(4):745-751.

［16］ 刘 畅，夏 晶，胡 青，等. LC/MS (n)法对中成药中非法添加9 种镇静催眠类化学药品检测方法的研究［J］.解放军药学学报，2009，3(23):70-72.

［17］ 高 青，车宝泉，张 喆，等. LC-MS/MS 法检查中药制剂及保健食品中非法添加的16 种镇静催眠药物［J］. 中国药科大学学报，2008，39(2):142-146.

［18］ 姚 羽，李慧义，张启明，等. 检测镇静安神类中成药中非法添加化学药品的方法研究［J］. 中国药学杂志，2007，42(3):224-227.