一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

韩 娇， 阳立波， 樊婷婷， 江海坤， 张其安， 方 凌， 任永兵， 马文佳， 曹树青*

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009；2.安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥 230009)

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

韩 娇1， 阳立波1， 樊婷婷1， 江海坤2， 张其安2， 方 凌2， 任永兵1， 马文佳1， 曹树青1*

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009；2.安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥 230009)

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能，构建拟南芥LWT1基因过表达载体，获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板，利用PCR扩增LWT1基因全长，将该基因连接到pART27载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101，通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中，利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株。[结果]LWT1基因CDS全长990 bp，PCR电泳结果一致，测序比对结果正确。通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株。[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系，为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。

拟南芥；LWT1基因；过表达；转基因植株

由于植物自身的固着性，各种不良环境因素都会限制它们的生长和发育,因此植物为自身的生长发育采取一系列防御反应来增加对外界环境的适应能力[1]。植物面对缺水情况会通过一系列的生理分子过程来提高植物本身的耐受性[2]。通过分子和基因组分析许多干旱诱导基因已经在拟南芥、水稻和其他植物中确定，其中包括一系列的调节胁迫诱导基因表达量的转录因子[3]。最近在分析参与胁迫反应的生化和生理途径中有重大进展，如一系列代谢反应为了适应干旱和高渗反应而反生改变[4]。胁迫诱导基因不仅在最初胁迫反应中起作用，而且还能增强植物的耐受能力[5]。低温环境对植物的生长和发育具有不利影响，许多植物经过冷驯化适应了低温环境，这主要是在转录、转录后、翻译后水平对基因的表达进行调控可以使植物适应低温环境[6-7]。转录水平的调节是由CBF诱导ICE1的表达，在低温适应中CBF转录因子和非依赖CBF的调节子串联在一起[8-9]。转录后水平的调节同样能提高植物对低温的耐受性。

合肥工业大学生物与食品工程学院分子生物学实验室在前期工作中筛选得到一个具有低温和干旱敏感表型的突变体lwt1-1，有望通过LWT1基因的研究,揭示植物在低温和干旱胁迫耐受过程中某些未知的调控机制。笔者通过构建LWT1过表达材料，从而为该基因分子功能的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验材料。拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚野生型( Col-0 )，购买于美国拟南芥种质资源中心，由合肥工业大学生物与食品工程学院分子生物学实验室繁衍保存。

1.1.2主要试剂。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒、总RNA抽提试剂盒、TaqPCR酶、限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ、高保真酶Phusion、T4DNA连接酶购于NEB公司,TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep MiniPlasmid kit购于天根公司维生素B5，Silwet L-77，蔗糖，MES，6--BA， KOH等。

1.1.3宿主菌和载体。大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，农杆菌感受态菌株GV3101，pART27载体(带有35S强启动子)。

1.2 方法

1.2.1拟南芥植株的土培。①按照蛭石∶黑土∶珍珠岩=9.0∶3.0∶0.5的比例混均营养土。将配制好的营养液倒入托盘中，待营养液被吸收完全后，即可播种拟南芥种子。②将待播种的拟南芥种子，按照需求均匀地点播在营养土的表面。③待拟南芥植株长大后，等培养盆中的水干透后再浇水。④待种子成熟后收种，放在30 ℃烘箱中干燥15 d后于-20 ℃保存。

1.2.2LWT1过表达载体的构建

1.2.2.1LWT1基因的获得。①利用软件设计所需引物，LWT1过表达载体选用KpnⅠ和XhoⅠ 2个酶切位点。所需引物：FR: 5′CGGggtaccATGTTCGCGCGAAGAC，PR: 3′CGGctcgagCCGCTTCTTCGCTTTCCTTA。②以cDNA为模板，用Pusion高保真扩增酶进行PCR扩增。

1.2.2.2LWT1基因与载体的重组。①将回收的目的基因以及pART27质粒用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ在37 ℃下进行酶切。②用T4DNA连接酶16 ℃过夜连接。③将连接产物转入到大肠杆菌感受态中，用含有50 μg/ml壮观霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆。④挑取长势正常的单菌落进行菌落PCR验证，阳性菌测序保存。

1.2.3浸花法转化拟南芥。将测序正确的质粒转化到GV3101农杆菌菌株，用含有50 μg/ml壮观霉素和50 μg/ml庆大霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑取单菌落进行菌落PCR验证，用转化成功的农杆菌进行侵染。

转化方法：将农杆菌摇菌至OD600=0.8左右，5 000 r/min离心10 min，离心所得菌体用渗透缓冲液重悬，至菌液稀释到OD600为0.8左右。将待转化的拟南芥花苞浸于渗透液中浸泡1～3 min，黑暗中放置12 h后放在正常环境中培养至收种。

1.2.4转基因阳性株系的筛选鉴定。将待筛选种子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上培养14 d，植株嫩绿能长出真叶和根的作为T1代植株进行移栽。

移栽的拟南芥植株培养28 d后，取拟南芥叶片用CTAB法提取基因组DNA。以DNA为模板扩增LWT1基因，以此去除假阳性植株。将筛选的阳性植株所收获的种子标为T2。

用T1代所收种子(T2)再用潮霉素筛选鉴定分离比，选取潮霉素耐受(HygR)比对潮霉素敏感(HygS)的比例为3∶1的T2进行后续试验。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增拟南芥LWT1基因为了获得LWT1基因，选取在MS培养基中正常生长14 d的野生型拟南芥幼苗，提取拟南芥RNA，用RT Kit反转录成cDNA，然后以cDNA为模板扩增LWT1基因片段。结果见图1a。由图1a可知，LWT1目标条带大小与实际数据大小一致，说明成功获得LWT1基因片段(990 bp)。同时提取pART27过表达菌株的质粒，并进行电泳检测，结果见图1b。由图1b可知，条带大小正确，条带清晰。

2.2 LWT1过表达载体的连接与转化用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ切割目的基因和pART27载体，酶切后进行电泳检测，结果见图2。由图2可知，酶切后的基因和载体条带清晰、大小正确，可用于下一步试验。

将酶切过的基因和载体用连接酶于16 ℃过夜连接，然后转化到Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞，用含有50 μg/ml Spec的LB平板筛选阳性单克隆。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定并电泳检测，LWT1过表达菌株的菌落PCR鉴定结果见图3。由图3可知，挑选的大部分单菌落都是阳性菌，扩增后条带大小也正确。

选取部分阳性菌进行测序。根据拟南芥网站上提供的LWT1基因的CDS序列与返回的测序结果进行比对，比对结果为100%，说明LWT1过表达载体构建成功。

2.3 转基因阳性植株的鉴定及筛选将所收种子撒到含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板上正常培养14 d。一般情况下，只有转化成功的拟南芥植株才会有潮霉素抗性，生长出正常的真叶与根。挑选生长嫩绿和长出根的幼苗进行移栽。抗性筛选结果见图4。

移栽的植株培养到21 d左右时，剪取LWT1转基因植株叶片提取DNA，在基因组水平上检测LWT1基因的表达水平。选取LWT1过表达载体的上下游引物从基因组水平上鉴定，结果见图5。由图5可知，凡是转化成功的拟南芥植株都成功扩增了LWT1基因。这说明LWT1过表达载体成功转化到拟南芥野生型植株中。

选择阳性苗单株收种子并标记为T2代，用含有30 μg/ml潮霉素的1/2 MS平板筛选，选择分离比为3∶1(单插入)的T2种子，选择对应单插入的阳性拟南芥植株进行后续试验。

3 讨论

干旱与低温胁迫是植物抗逆研究的重点,现代分子生物学技术的发展为这一领域的研究注入了新的活力。目前同时具有抗寒和抗旱功能的基因甚少,而发现的LWT1基因同时具有抗寒与抗旱的功能。研究其抗寒与抗旱机制,对于农林业的抗寒与抗旱育种研究具有重要的现实意义。随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，利用转基因技术将外源抗逆基因导入植物基因组，该技术在提高植物抗逆性、改良作物遗传性状及培育农作物优良品系等方面具有广阔的应用前景[10-11]。

该试验通过遗传学方法构建转基因过表达材料，可以用于研究LWT1基因在干旱和低温胁迫调控过程中的生化和分子机制，为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。

[1] CHEONG Y H,KIM K N,PANDEY G K,et al.TCBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt,drought, and cold responses inArabidopsis[J]. The Plant Cell,2003, 15:1833-1845.

[2] OSAKABE Y,MIZUNO S,TANAKA H. Overproduction of the membrane-bound receptor-like protein kinase 1, RPK1, enhances abiotic stress tolerance inArabidopsis[J]. The Journal of Biological Chemistry,2010,12:9190-9201.

[3] NEMHAUSER J L, HONG F, CHORY J. Different plant hormones regulate similar processes through largely nonoverlapping transcriptional responses[J]. Cell, 2006, 126(3): 467-475.

[4] AKHTAR M, JAISWAL A, TAJ G, et al. DREB1/CBF transcription factors: their structure, function and role in abiotic stress tolerance in plants[J]. Journal of Genetics, 2012, 91(3): 385-395.

[5] AGARWAL M, HAO Y, KAPOOR A, et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(49): 37636-37645.

[6] VLACHONASIOS K E, KALDIS A, NIKOLOUDI A, et al. The role of transcriptional coactivator ADA2b in Arabidopsis abiotic stress responses[J]. Plant Signaling & Behavior, 2011, 6(10): 1475-1478.

[7] FUJII H, ZHU J K. Osmotic stress signaling via protein kinases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2012, 69(19): 3165-3173.

[8] NAKASHIMA K, TAKASAKI H, MIZOI J, et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2012, 1819(2): 97-103.

[9] TRAN L S P, NAKASHIMA K, SHINOZAKI K, et al. Plant gene networks in osmotic stress response: from genes to regulatory networks[J]. Methods in Enzymology, 2007, 428: 109-128.

[10] 吕申超，王海涛，鱼斌，等.拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建[J].合肥工业大学学报：自然科学版，2012,35(1)：120-123.

[11] 侯文胜，郭三堆，路明，等．利用转基因技术进行植物遗传改良[J]．生物技术通报，2002(1):10-15．

Construction and Characterization of a Drought / Cold Tolerant Gene Overexpression Lines inArabidopsis

HAN Jiao, YANG Li-bo, FAN Ting-ting, CAO Shu-qing*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] In order to further confirm thatLWT1 gene is involved in the regulation of low temperature and drought stress responses, the transgenic lines ofLWT1 overexpression were generated. [Method] The full-lengthLWT1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA ofArabidopsisthaliana(Col-0) using specific primers and cloned into the pART27 vector. The resulting construct was transformed intoAgrobacteriumstrainGV3101 for transformation into the Col-0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification. [Result] The PCR product is 990 bp which is the same as the full-lengthLWT1 CDS. The transgenic plants is gained and verified by genetic identification. [Conclusion] The vector was constructed successfully, and transgenic plants were obtained. The study will lay a foundation for further study.

Arabidopsis;LWT1 gene; Overexpression; Transgenetic lines

安徽省自然科学基金青年基金项目(1308085QC56)；安徽省科技攻关项目(1201a0301009)。

韩娇(1989- )，女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：分子基因调控。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事植物抗逆基因克隆及应用研究。

2015-03-25

S 188

A

0517-6611(2015)13-048-03