中药黄檗对金黄色葡萄球菌体外抑菌效果的初步研究

赵凌旭，王蕾

(上海中医药大学附属龙华医院，上海200032)

中药黄檗对金黄色葡萄球菌体外抑菌效果的初步研究

赵凌旭，王蕾

(上海中医药大学附属龙华医院，上海200032)

目的研究中药黄檗对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果。方法采用琼脂稀释法、常量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法检测黄檗水煎剂对20株金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果琼脂稀释法抑制90%菌株生长的MIC(MIC90)为12.5 mg/mL，常量肉汤稀释法MIC90为25 mg/mL，微量肉汤稀释法MIC90为25 mg/mL。结论中药黄檗对金黄色葡萄球菌在体外有较好的抑菌效果。

黄檗;金黄色葡萄球菌;体外抑菌

黄檗是芸香科植物黄皮树及黄柏树除去栓皮的干燥树皮，其性味苦寒，入肾、膀胱、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、清虚热的作用［1］。临床上，黄檗常作为清热利湿熏洗剂的一味中药之一，其对包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等均具有一定的抑菌作用［2］。有研究表明，黄檗中主要的抗菌成分是小檗碱，但其还含有巴马亭、药根碱、黄柏碱和黄柏酮等其他一些抗菌成分［3］。我们采用3种不同的药物体外抑菌试验检测黄檗水煎剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，观察黄檗抗菌成分的联合抗菌作用。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源选取20株金黄色葡萄球菌，其中包含1株药物敏感性质控菌株——金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)，其余19株分离自临床脓液样本，经VITEK 2 Compact系统鉴定均为非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

2.试剂与仪器黄檗、水解酪蛋白胨肉汤(美国Oxide公司)、水解酪蛋白胨琼脂(美国Oxide公司)、高压灭菌锅、微量加样枪和比色仪等。

二、方法

1.黄檗水煎剂的制备用传统煎煮法将黄檗制成单味水煎剂［4］。制法:将100 g黄檗略粉碎后置于烧杯中，加水200 mL加热煮沸30 min，过滤后将药渣再加水100 m L加热煮沸30 min，合并2次煎液后过滤，再将滤液加热浓缩至200 mL，其生药浓度为500 mg/mL，表示每毫升水煎剂中相当于含黄檗生药500 mg，装瓶4℃冷藏备用［5］。

2.菌液的制备取20株金黄色葡萄球菌分别接种于水解酪蛋白胨平板，置35℃温箱培养过夜。用无菌接种环挑取菌落，生理盐水校正至0.5麦氏浊度［约为(0.1～0.2)×1012cfu/L］，再用肉汤1∶10稀释成含菌量为(1～2)×107cfu/mL的菌液。

3.琼脂稀释法抑菌试验将黄檗水煎剂用无菌水稀释成9个浓度梯度(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91和1.95 mg/mL)的药液。取36 g水解酪蛋白胨琼脂粉加1 L无菌水置于合适的玻璃瓶中，121℃高压灭菌15 min。将各浓度的药液2和18 mL高压后的水解酪蛋白胨琼脂培养基混匀倾注平板，制备成含黄檗浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391和0.019 mg/mL的琼脂平板，冷却待用，另取不含药液的水解酪蛋白胨平板做无菌对照和细菌生长对照［6］。取菌液2 μL接种于平板，置35℃温箱培养18 h后观察结果。检查无菌对照平板不长细菌，生长对照平板长菌证明试验有效，药物最低浓度平板无细菌生长者即为受试菌的最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

4.常量肉汤稀释法抑菌试验按照美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准执行。将黄檗水煎剂用肉汤稀释成200 mg/mL备用。取11支高压灭菌玻璃试管排成一列，每管加入2 mL水解酪蛋白胨肉汤，在第1管中加入稀释后的黄檗水煎剂2 mL混匀，然后吸取2 mL至第2管，混匀后吸取2 mL至第3管，依次类推。第9管吸取2 mL弃去。此时各管的药物浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781和0.391 mg/mL。第10管为不加药液的受试菌对照管，第11管为不加药液的无菌肉汤对照管。于1至10管中加入0.1 mL调整好的菌液，此时每管最终菌液浓度为5×105cfu/m L。置于35℃温箱培养18 h后观察结果。检查无菌对照管不长细菌，受试菌对照管长菌证明试验有效。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者即为受试菌的MIC。

5.微量肉汤稀释法抑菌试验此方法由常量肉汤稀释法改进而来。按上述方法制备10个浓度梯度的培养基。取无菌96孔U型板，将配制好的含药培养基200 μL分别加入一排孔中，使每一排的浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391和0 g/m L。第10孔为不加药液的受试菌对照管，第11孔为不加药液的无菌肉汤对照管。第1至10孔中加入调整好的菌液10 μL，此时每孔含菌最终浓度为5× 105cfu/mL。同时设第1列为空白孔。接种后的U型板以第1列为空白孔调零，以600 nm测定各孔初始吸光度(A)值3次求得平均值作为本底。置于35℃温箱培养18 h后再次测定其A值3次并求平均值。培养后测定的A值减去同浓度的本底A值即为试验微孔的A净值，根据净值判断MIC。根据计算，A净值＞0.02视为有菌生长。

结果

一、琼脂稀释法抑菌试验

20株金黄色葡萄球菌检测结果显示，黄檗水煎液在6.25 mg/mL浓度时累积抑菌率为40%，12.5 mg/mL浓度时累积抑菌率为100%，故抑制90%菌株生长的MIC(MIC90)为12.5 mg/mL。见表1。

二、常量肉汤稀释法抑菌试验

20株金黄色葡萄球菌检测结果显示，黄檗水煎液在12.5 mg/mL浓度时累积抑菌率为40%，25 mg/mL浓度时累积抑菌率为100%，故MIC90为25 mg/m L。见表1。

表1 琼脂稀释法和常量肉汤稀释法检测黄檗对金黄色葡萄球菌的MIC值(mg/mL)

三、微量肉汤稀释法抑菌试验

20株金黄色葡萄球菌检测结果显示，黄檗水煎液在12.5 mg/mL浓度时累积抑菌率为45%， 25 mg/mL浓度时累积抑菌率为100%，故MIC90为25 mg/mL。见表2。

表2 微量肉汤稀释法检测黄檗对金黄色葡萄球菌的A净值

讨论

金黄色葡萄球菌是化脓性感染中最常见的致病菌之一［7］，可引起人类局部化脓性感染，如痈、疖等。近年来，随着合成及半合成抗菌药物的增多和广泛使用，临床上金黄色葡萄球菌的耐药性问题日趋严重［8］。中药作为我国传统医学的重要组成部分，药源广泛，价格低廉，含有多种活性成分，具有广谱抗菌作用，在动物体内不易产生耐药性，尤其在一些慢性感染过程中和急性感染的后期使用中草药不仅能抗菌消炎，还具有全面的调理作用［9］。黄檗作为中医外科复方熏洗剂的一味中药之一，其具有广谱的抗菌作用。本研究借鉴细菌体外药物敏感性试验方法，对黄檗水煎剂进行抗金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验。

有研究发现，黄檗含有多种广谱抗菌成分，主要成分为小檗碱(又称黄连素)，而其他生物碱成分如巴马亭、黄柏碱也具有相同的基本分子骨架，即原小檗碱类生物碱分子骨架和芳型季钱氮结构，抑菌谱理论上不会产生较大差异［10］。小檗碱属异喹啉类生物碱，有研究发现其能够穿透磷脂双分子膜和金黄色葡萄球菌细胞膜，是一种穿透性阳离子和多药耐药泵作用物［11］。原小檗碱立体结构与四环素类和喹诺酮类结构叠合较好，作用机制有相似之处，可能通过抑制细菌核蛋白体30S亚基或DNA回旋酶A产生抑菌作用［12］。周树勤等［13］研究表明，小檗碱能使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的自溶酶条带增强，自溶酶谱增宽，提示小檗碱可能激活金黄色葡萄球菌的自溶酶系统，使自溶酶表达增加，或使自溶酶水解细胞壁的活性增强，这可能为小檗碱用于抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的治疗提供理论依据。

体外抑菌结果显示，黄檗水煎液在25 mg/mL的生药浓度下即可抑制所有试验菌株，提示其在体外具有较强的抑制金黄色葡萄球菌的能力。进一步比较3种方法，常量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法测定的MIC90值要高于琼脂稀释法，这可能与细菌的培养环境(液体和固体培养基)有关，也有可能与中药的作用方式(细菌与药液直接接触，细菌与含药琼脂表面接触)有关，需做进一步试验。琼脂平板稀释法结果直观、易判断且容易发现污染菌，但含药琼脂培养基制作比较复杂、耗时，临床实验室不易推广。常量肉汤稀释法是目前临床实验室测定中药抑菌效果比较常用的方法，操作简单，但由于部分中药水煎剂本身具有比较深的底色，对结果判断有一定的干扰。微量肉汤稀释法利用U型板代替玻璃管，同时利用比色仪代替肉眼观察，方法简单且判断方便，结果与常量肉汤稀释法一致，可以作为临床实验室测定中药抑菌效果的方法。郭丽双等［14］研究表明，采用微量肉汤稀释法在不同时间段测定A值，可以绘制细菌在不同药物浓度下的细菌生长曲线，提示中药不同成分对细菌生长的不同作用。

本研究采用的体外抑菌试验表明，黄檗在体外对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，这为黄檗治疗金黄色葡萄球菌感染提供了一种新的探索。但中药受体外和体内作用环境不同的影响，抑菌结果并不完全一致。因此本研究所得单味黄檗水煎剂对金黄色葡萄球菌的MIC90值仅为体外抑菌效果，不足以阐明其对整个机体的影响，并不能完全反映其在体内的药物浓度和抗菌作用，这也是目前单味中药体外抑菌试验的局限性。

［1］张义虎，孙静.黄柏的临床应用总述［J］.中国医学创新，2010，7(3):182-183.

［2］李峰，贾彦竹.黄柏的临床药理作用［J］.中医药临床杂志，2004，16(2):191.

［3］王跃华，徐文俊，何俊蓉，等.川黄柏离体培养及药用成分的抑菌试验研究［J］.中国中药杂志，2004，29(10):1002-1003.

［4］夏美玲，吕丽艳，刘野，等.5种中草药体外抑菌实验的研究［J］.齐齐哈尔医学院学报，2009，30 (24):3024-3025.

［5］张景皓，李艳红，赵虎.五味子对鲍曼不动杆菌体外杀菌和抑菌作用的研究［J］.检验医学，2014，29 (6):664-667.

［6］王秀华，李仲兴，张新华，等.五倍子等14种中药对112株表皮葡萄球菌的抗菌活性观察［J］.解放军药学学报，2007，23(4):275-277.

［7］徐红云，刘春林，李宜铮，等.伤口感染病原菌分布及耐药谱分析［J］.中国微生态学杂志，2013，25 (11):1313-1316.

［8］胡仁静，严子禾，胡锡池.金黄色葡萄球菌的耐药分析［J］.职业与健康，2009，25(24):2859-2860.

［9］李娟，李晓东，杨丽霞，等.单味中药体外抑菌活性的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17 (11):283-286.

［10］杨勇，叶小利，李学刚.4种黄连生物碱的抑菌作用［J］.时珍国医国药，2007，18(12):3013-3014.

［11］SEVERINAⅡ，MUNTYAN MS，LEWIS K，et al.Transfer of cationic antibacterial agents berberine，palmatine，and benzalkonium through bimolecular planar phospholipid film and Staphylococcus aureus membrane［J］.IUBMB Life，2001，52(6):321-324.

［12］李波，朱维良，陈凯先.小檗碱及其衍生物的研究进展［J］.药学学报，2008，43(8):773-787.

［13］周树勤，姚芬，黄源春，等.小檗碱对MRSA自溶酶系统作用的研究［J］.中国感染与化疗杂志，2012，12(4):310-312.

［14］郭丽双，葛立男，宋宝辉，等.中药体外抑菌实验检测方法的比较［J］.中医学报，2011，27(10):1207-1208.

Primary investigation on in vitro bacteriostatic action of Amur-cork tree to Staphylococcus aureus

ZHAO Lingxu，WANG Lei.(Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China)

ObjectiveTo investigate in vitro bacteriostatic action of Amur-corktree to Staphylococcus aureus.MethodsThe minimum inhibitory concentrations(MIC)of Amur-corktree to 20 isolates of Staphylococcus aureus were determined by agar dilution method，normal dilution method and micro-dilution method.ResultsThe MIC for inhibiting 90%bacteria(MIC90)of agar dilution method was 12.5 mg/mL，the MIC90 of normal dilution method was 25 mg/mL，and the MIC90 of micro-dilution method was 25 mg/mL.ConclusionsIt exists an obvious in vitro bacteriostatic action of Amur-corktree to Staphylococcus aureus.

Amur-corktree;Staphylococcus aureus;In vitro bacteriestasis

1673-8640(2015)09-0886-04

R378.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.005

2014-12-19)

(本文编辑:姜敏)

赵凌旭，男，1986年生，学士，技师，主要从事微生物检验工作。

王蕾，联系电话:021-64385700。