液基薄层制片技术制作外周血淋巴细胞涂片方法学的建立及免疫组化染色应用

孔庆暖 王丽娜 韩增磊 黄维清▲

1.山东省青岛市市立医院病理科，山东青岛266071；2.山东省青岛市第六人民医院暨青岛市传染病医院检验科，山东青岛266000

液基薄层制片技术制作外周血淋巴细胞涂片方法学的建立及免疫组化染色应用

孔庆暖1王丽娜1韩增磊1黄维清1▲

1.山东省青岛市市立医院病理科，山东青岛266071；2.山东省青岛市第六人民医院暨青岛市传染病医院检验科，山东青岛266000

目的应用液基薄层制片技术制作外周血淋巴细胞涂片，以期建立更加简单直观且能够与分子生物学相结合的外周血淋巴细胞形态学检查方法。方法利用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，液基细胞保存液中过夜保存，液基薄层涂片技术制作细胞涂片，并通过SP免疫组化染色观察T淋巴细胞及B淋巴细胞表面抗原CD3和CD20在涂片淋巴细胞中的表达，并通过表达部位获取两种抗原的免疫表型保存情况。结果对5名健康者外周静脉血制作淋巴细胞涂片，淋巴细胞获得率达95%以上，形态保存完好，SP免疫组化法显示，CD3和CD20抗原均清晰表达在相应淋巴细胞亚群的细胞膜上，通过免疫组化法计数的淋巴细胞亚群比例和文献结果相一致。结论与传统外周血手工涂片相比，液基薄层制片技术制作外周血淋巴细胞涂片可快速有效地应用于外周血淋巴细胞形态学观察和免疫组化染色，对临床淋巴细胞亚群分类、淋巴瘤分型及预后判断有重要的应用价值。

外周血；淋巴细胞；液基薄层制片；免疫组化

目前外周血形态学检测主要是应用传统血涂片的方法，但是存在重复性差、涂片质量较低等缺点，且对淋巴系统相关病变引起的外周血淋巴细胞形态学改变不能细致观察，漏诊率高，无法应用于下一步的分子生物学检测［1］。液基细胞学，简称TCT（ThinPrep Cytology Test），是一种将脱落细胞保存在液体中，并通过特殊设备将细胞均匀分散贴附在载玻片上制成涂片的技术，20世纪90年代中后期开发［2］，目前主要在病理科应用于宫颈细胞学及体腔脱落细胞学检测，它是通过机械、气动与流体力学原理，用全自动设备将细胞涂成均匀的薄层标本，其操作方法简单，细胞形态和细胞表面相关抗原保存良好，技术水平先进［3-4］。因此，本研究通过反复实验和条件调整，将液基薄层制片技术与外周血淋巴细胞提取相结合，跨学科建立了一种可清晰准确地观察外周血淋巴细胞形态的方法，经过验证该方法可应用于进一步SP免疫组化染色，该方法的建立将为恶性淋巴瘤的临床诊疗及判断预后带来新的思路，有非常广阔的应用前景。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择健康自愿捐献外周血者5名，均无淋巴造血系统疾病等慢性病史、恶性肿瘤病史、近期急性感染病史，1个月内未服用任何药物；男2名，女3名，年龄25～43岁，平均32.6岁；每人抽取外周静脉血3 mL，常规EDTA抗凝管抗凝。

1.2 主要试剂和仪器

淋巴细胞分离液（北京Solarbio）；液基细胞处理试剂盒（宁波美生医疗器材有限公司）；兔抗人CD3单克隆抗体（1∶200，福建迈新生物技术有限公司）；兔抗人CD20单克隆抗体（1∶300，福建迈新生物技术有限公司）；自动细胞制片机（宁波美生医疗器材有限公司）；低温冰箱（青岛海尔）；可控式恒温干燥箱（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司）。

1.3 外周血淋巴细胞提取

应用Ficoll-hypaque密度梯度离心法（1800 r/min）分离淋巴细胞，具体步骤如下：吸取新鲜EDTA抗凝血（30 min内）2 m L，室温下13 000 r/min离心3 min，去除上层血浆后加入4 m L淋巴细胞分离液，低温离心机离心30 min（4℃，1800 r/min），小心缓慢吸取第2层白色絮状物（淋巴细胞层），用Hanks液低速离心洗涤细胞3次，将沉淀细胞保存于液基细胞处理试剂盒（内含细胞保存液3mL）内，轻微震荡后室温过夜。

1.4 淋巴细胞液基涂片制备

取2 mL室温过夜后的上述细胞保存液，常温下用自动细胞制片机离心5 min（1800 r/min），淋巴细胞离心于自动细胞制片机内的黏附载玻片上，制备成直径2 cm的薄层液基细胞涂片，室温5 min晾干，在预冷的4℃纯丙酮中固定20 min后进行Giemas染色评估淋巴细胞形态及淋巴细胞百分比。

1.5 免疫组化染色

上述纯丙酮固定的淋巴细胞涂片经PBS冲洗（3次，5 min/次）后，采用柠檬酸盐（1∶100，pH 6.0）微波修复，将柠檬酸溶液放于微波炉中加热至沸腾后放入涂片，持续2.5 min，自然冷却后加入3%过氧化氢孵育30min，PBS冲洗（3次，5min/次），滴加50μL一抗4℃过夜（兔抗人CD3、CD20单克隆抗体），PBS冲洗（3次，5 min/次），二抗（通用型IgG抗体）37℃孵育10 min，PBS冲洗后（3次，5min/次）DAB显色3 min，苏木精复染30 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。

2 结果

2.1 淋巴细胞形态及比例评价

传统外周血涂片是应用推片技术制作，优点在于能够观察全血细胞的形态学改变，但由于受到手工操作限制，存在方法操作一致性差、细胞涂片过厚、由于红细胞过多对淋巴细胞形态观察不仔细等缺点，而且涂片观察有时间性的限制。应用液基细胞技术制备的淋巴细胞涂片，残余红细胞可被细胞保存液有效破坏，且细胞经过固定，采用中性树胶封片，保存时间长久。Giemas染色证实，该方法制备淋巴细胞涂片细胞操作简单，一致性好，形态完整，细胞核清晰，核膜圆滑，无细胞自溶胀大，无皱缩脱水等现象，5张涂片淋巴细胞比例均96%以上。见图1（封四）。

2.2 免疫组化染色评估

免疫组化抗体CD3抗原标记T淋巴细胞亚群，CD20抗原标记B淋巴细胞亚群，两者阳性标记均为细胞膜棕黄色颗粒沉积。染色完成后每张涂片计数100个细胞，统计阳性染色T淋巴细胞及B淋巴细胞比例。SP免疫组化染色结果显示，CD3及CD20抗体均在淋巴细胞细胞膜完整清晰表达（图2、3，封四），统计结果显示，5名健康者外周血中T淋巴细胞所占比例平均80.6%，B淋巴细胞所占比例平均6.6%，见表1。T淋巴细胞及B淋巴细胞比例与流式细胞学等检测方法结果基本一致［5-8］。

表1 免疫组化检测5名健康者T淋巴细胞和B淋巴细胞比例（%）

3 讨论

外周血检测创伤性小，简单快速，标本易于获得，可检测指标广泛，是临床辅助检查的重要工具［9］。随着恶性淋巴瘤发病率的逐年上升，外周血对于早期发现异形淋巴细胞、淋巴瘤患者的临床特征，评估治疗效果及淋巴瘤预后监测等有重要的价值［10-11］。王冰洁等［12］研究表明，不同淋巴瘤类型呈现不同的EBV感染状态，外周血EBV-DNA阳性为影响淋巴瘤患者总生存率的独立预后因素。然而由于流式细胞学和其他分子生物学等新技术的飞速发展，以外周血涂片为主的传统血液形态学因为涂片质量等原因受到极大的发展限制［13-14］。液基薄层制片技术是近几年迅速发展的细胞学检测方法，目前主要应用于妇科及胸腹腔脱落细胞学检查，在病理科应用较为广泛［4，15-16］。近年来免疫组化在液基细胞学中的应用价值已得到广泛证实：P16和Ki67免疫组化联合应用能显著提高宫颈上皮内瘤变的液基细胞阳性率；在胸腹水脱落细胞学中，免疫组化能够清晰地标记出恶性肿瘤细胞并进行肿瘤分型［17-19］。本研究将该技术应用到血液学检查中，发现通过这种方法保存和制作的淋巴细胞涂片，操作简单，制作的细胞形态完整清晰，且能够应用于进一步的免疫组化检查。

众所周知，固定液的成分对细胞抗原保存非常重要，固定液的不正确应用可导致细胞膜上的抗原丢失，对后续免疫组化产生假阴性结果。在实验过程中，笔者对比了纯酒精、10%中性甲醛、常温丙酮及4℃纯丙酮4种不同的固定液成分，通过反复条件调整和摸索，确认4℃纯丙酮是最佳固定试剂，将丙酮提前24 h放入4℃冰箱预冷，该方法不仅可以为后续免疫组化保存了完整的抗原，且细胞黏附力好，在反复冲洗过程中不易脱片，该方法也是借鉴了妇科脱落细胞免疫组化的固定条件［20-21］。本研究所用的液基细胞保存液是成熟的商业化产品，所含成分能够有效地破坏残余红细胞，完全去除红细胞对涂片质量的影响，因此淋巴细胞得率高，基本保存了外周血中所有淋巴细胞类型，能够反映外周血淋巴细胞的基本情况。CD3和CD20是淋巴细胞的重要标志物，分别表达在T淋巴细胞及B淋巴细胞细胞膜上。现有研究表明，血液中淋巴细胞分类以T淋巴细胞为主，比例占80%左右，B淋巴细胞比例为3%～10%不等，笔者通过免疫组化证实，该方法所获得淋巴细胞比例与之前的研究结果基本一致［5-8］，因此该方法对淋巴细胞亚群分型有重要的应用价值。

目前广泛应用的分子生物学方法虽然对鉴定早期病例及患者预后和治疗有重要意义，但同时存在一定的缺点，例如假阳性率高，对血液异常成分或异型淋巴细胞不能及时发现和鉴别，特别是对形态学作为主要诊断标准的淋巴系统疾病不能提供基本信息等。因此，血液形态学仍然应该做为分子生物学技术的重要基础和补充，两者互为促进，互相发展才能够发现新的病种和类型，对血液疾病有更加深入的认识［22-23］。本研究属于方法学的跨领域使用。应该认识到，生物医学迅猛发展的今天，多学科、多领域的交流与合作是解决病因病理，治疗疑难疾病的重要里程，因此，血液做为临床辅助检查的重要目标，应该通过多种渠道和实验学方法，深入发现及挖掘其自身的价值和潜力，不放过一丝蛛丝马迹，使其为临床提供尽可能多而有价值的参考数据。

本研究将液基薄层制片技术和血液形态学结合起来，创建了一种可用于免疫组化的检测外周学淋巴细胞形态的新方法，该方法将对淋巴系统疾病的血液学检查创立了新的思路，而且可以应用免疫组化对淋巴瘤亚型进行进一步分类，对淋巴细胞亚群的研究有重要的临床应用价值，因其取材简便，制备技术简单，可为临床判断淋巴瘤预后、监测化疗指标提供新的方法。

［1］覃小梅，刘勇，陆颖.外周血异型淋巴细胞检测的临床意义［J］.检验医学与临床，2011，8（15）：1882-1883.

［2］周晓倩.液基细胞薄层涂片技术的临床应用价值［J］.中国当代医药，2012，19（3）：99-100.

［3］李小华，张云霄，冬国友，等.全自动制片染色系统制作优质液基细胞片方法的探讨［J］.山西医药杂志，2013，（24）：1433-1434.

［4］欧陵斌，杨晓斌，柏彬，等.4种液基细胞制片的比较［J］.临床与实验病理学杂志，2013，29（4）：457-459.

［5］董静懿，宁小晓，王蕾，等.上海地区健康成年人外周血T淋巴细胞亚群参考区间调查［J］.检验医学，2014，（6）：617-621，627.

［6］黄柏炎，孙荭，曾洁铭，等.心理应激对正常人外周血T淋巴细胞体外活化表面分子表达的作用［J］.中国病理生理杂志，2000，16（3）：229-232.

［7］徐瑞龙，郑昭璟.外周血B淋巴细胞免疫表型分析及临床应用［J］.中国实验诊断学，2004，8（2）：111-114.

［8］郑昭璟，徐瑞龙.健康成人外周血B淋巴细胞流式细胞术免疫表型分析：慢性B细胞白血病/淋巴瘤诊断参考值［J］.中国实验血液学杂志，2003，11（4）：398-404.

［9］Mohr S，Liew CC.The peripheral-blood transcriptome：new insights into disease and risk assessment［J］.Trends Mol Med，2007，13（10）：422-432.

［10］马芹，张会来，王华庆，等.外周血淋巴细胞绝对数对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后价值的临床分析［J］.中国肿瘤临床，2014，（8）：503-507.

［11］陈珍珠，尹青松，魏旭东，等.TRAF6，TAK1和TGF-β基因在弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗前后外周血单个核细胞中的表达［J］.中国实验血液学杂志，2014，22（5）：1301-1305.

［12］王冰洁，岑溪南，梁赜隐，等.外周血EBV-DNA水平对淋巴瘤患者临床特征及预后的预测意义［C］.天津：中国肿瘤内科进展，2014.

［13］高杰.外周血涂片分类计数白细胞初诊48例血液病［J］.实验与检验医学，2012，30（2）：209-210.

［14］胡昊.98例成人贫血患者的血细胞形态学诊断分析［J］.国际检验医学杂志，2014，（12）：1640-1641.

［15］阮雅君，夏朝霞，方建晨.胸水常规及新柏氏液基制片在免疫细胞化学染色中的应用［J］.现代实用医学，2012，24（9）：1055-1056.

［16］李艳，陈建萍，何蓉.薄层液基细胞学技术在痰脱落细胞检查中的临床应用价值［J］.江西医药，2013，48（2）：164-166.

［17］王兴波，王静，冯冬青，等.体腔积液薄层液基细胞涂片免疫组化染色方法研究［J］.中国医药导报，2013，10（28）：17-19.

［18］谭永兴，江卫民，李艳梅，等.液基细胞制片免疫组化染色在胸腹腔积液诊断中的应用［J］.转化医学杂志，2014，（3）：147-149.

［19］陆晓青，陈洁瑛，舒青青，等.宫颈液基薄层脱落细胞联合HPV及p16检测在宫颈癌早期筛查中的临床意义［J］.浙江医学，2014，（13）：1147-1149.

［20］杨彦华，常宏，于建宪，等.p16^INK4a和Ki-67免疫细胞化学染色在宫颈液基细胞学中的应用价值［J］.诊断病理学杂志，2009，（3）：4-6.

［21］杨彦华.液基细胞学标本中p16^INK4a、Ki67的表达及导流杂交HPV分型在子宫颈癌及癌前病变中的意义［D］.青岛：青岛大学，2008.

［22］张智慧孙耘田.免疫细胞化学在细胞病理学中的应用［J］.中华病理学杂志，2005，34（10）：672-673.

［23］卢兴国，丛玉隆.应重视和提升传统血液形态学检验诊断水平［J］.中华检验医学杂志，2006，29（6）：481-482.

Establishm ent of preparing lym phocytes smears w ith thinprep liquidbased technology in blood and app lication of imm unostaining

KONG Qingnuan1WANG Li'na2HAN Zenglei1HUANGWeiqing1▲
1.Department of Pathology,Qingdao Municipal Hospital,Shandong Province,Qingdao 266071,China;2.Department of Clinical Laboratory,the Sixth People's Hospital of Qingdao City Qingdao City Hospital for Infectious Diseases,Shandong Province,Qingdao 266000,China

Objective To develop a new morphological examination method which make smears of lymphocytes in peripheral blood as well as applied with immunohistochemistry using thinprep liquid-based technology.Methods After separated by Ficoll-hypaque density centrifugation,lymphocytes in peripheral blood were preserved in special Preserv-Cyt Solution overnight.And liquid-based smears were prepared with cytospin on the principle of thinprep cytologic test.The immune phenotype of lymphocytes were observed with CD3 and CD20 immunohistochemistry staning.Accurate expression location indicated the condition of antigen preservation in lymphocytes.Resu lts The lymphocytes yields of five healthy volunteers reached up to 95%with complete and clear cellmorphology.CD3 and CD20 were accordingly expressed on cellmembranes of two lymphocyte subsets.The proportion of the two lymphocyte subsets calculated by immunohistochemstry staining was in accordance with previous literature.Conclusion The application of preparing lymphocytes smears with thinprep liquid-based technology in blood method in lymphocytesmorphology observation and immunohistochemistry staining is rapid and effective compared with conditionalmanual blood smears.Themethod also has important values on lymphocyte subsets classification,lymphoma classification and prognosis.

Peripheral blood;Lymphocytes;Thinprep liquid-based technology;Immunohistochemistry

R446.111

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0023-04

2015-03-11本文编辑：程铭）

山东省青岛市公共领域科技支撑计划项目［11-2-3-2-（3）-nsh］。

孔庆暖（1980-），女，硕士研究生，主要从事肿瘤病理研究。

▲通讯作者