保康野生蜡梅花与叶基因组DNA提取方法的研究

杨艳容

(襄阳职业技术学院，湖北襄阳 441050)



保康野生蜡梅花与叶基因组DNA提取方法的研究

杨艳容

(襄阳职业技术学院，湖北襄阳 441050)

[目的]证实从蜡梅花基因组提取DNA等同于从叶基因组提取DNA。[方法]采用CTAB法，对保康野生蜡梅花与叶基因组进行遗传多样性研究。 [结果]在用CTAB法提取DNA时，65 ℃水浴振荡并二次抽提后花基因组DNA在浓度和OD260/OD280上都与叶基因组DNA达到相近的水平。[结论]从性状表现更显著的蜡梅花基因组提取DNA进行遗传性分析能达到叶基因组的水平。

蜡梅；花；叶；提取；扩增

植物ISSR分子标记中DNA提取材料多为植物的嫩叶，关于花基因组DNA提取的方法尚未见报道。蜡梅是较特殊的材料，其冬季开花，野生种多分布于偏远山区，生境常为坡地、沟谷、 悬崖、石隙等，采集材料较为困难，且形态分类上花部特征是其分类的主要指标，因而结合形态学观察采集蜡梅的花提取花基因组DNA并进行遗传多样性分析显得更有意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试蜡梅花与叶片的材料均采自保康刺滩沟林场，采样时间2007年12月16日和2008年3月28日。

1.2 主要试剂CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8．0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，3% CTAB，2% PVP，1% β-巯基乙醇)，氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)。

PCR试剂中的Primer、MgCl2、PCR Buffer，上海生工生物工程有限公司，dNTP、TaqDNA聚合酶，北京鼎国生物技术责任有限公司。其他药品由上海国药集团提供，以上药品均为分析纯。

1.3 保存方法用剪刀剪取蜡梅的花或叶片，将花或叶片放入装有5倍体积变色硅胶的密封袋中，室温下保存。待硅胶变色后立即更换，直到花或叶片变脆。

1.4 基因组DNA的提取采用改良CTAB法[1]提取蜡梅基因组DNA，材料为8组对应的蜡梅花与嫩叶。提取方法：①称取200 mg硅胶干燥后的花瓣片或嫩叶(干样称50 mg)，将其放入研钵中，再加入液氮，研磨成粉末状，然后分装入2个2 ml的圆头离心管中，将65 ℃预热的CTAB提取液700 μl加入迅速混匀；②将混匀的离心管放入65 ℃水浴80 min，每隔10 min轻摇一次，取出冷却至室温；③将等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)加入离心管中，将其缓慢颠倒混匀，然后抽提15 min直至溶液呈乳浊状，12 000 r/min下离心20 min；④用剪掉端部的枪头小心地吸取上清液，将其转入新的1.5 ml离心管中，加入-20 ℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒使其混合均匀；⑤将混合均匀的离心管置于-20 ℃冰箱，静置1 h后将其取出，8 000 r/min离心2 min，将上清液弃之，然后用70%无水乙醇洗涤沉淀2次，每次10 min，放置于室温下进行干燥；⑥加入200 μl TE溶解DNA沉淀，然后加入2 μl Rnase(10 mg/ml)，在37 ℃下保温1 h去除RNA，5 000 r/min离心2 min，将上清液吸至新的1.5 ml离心管，去除底部未溶的沉淀。最后将上清液保存于-20 ℃备用。

1.5 DNA的电泳检测及紫外吸收检测(1)琼脂糖凝胶电泳检测：将待测DNA与稀释好的作为标准用的λDNA同时在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，然后通过0.5%EB染色，用Gel DocTM EQ凝胶成像仪系统在紫外光下拍照，粗略估算各样品的DNA浓度，同时检测总DNA分子大小以及基因组是否降解。

(2)紫外吸收检测：将待测DNA样品用TE缓冲液稀释至3 ml，保证其浓度在5～50 μg/ml，将其作为待测液。以TE作为参比液调零，用Varian UV-100紫外可见光分光光度计分别测定波长260 nm和280 nm的光吸收值，根据A260估算样品DNA得率，最后根据OD260/OD280判断DNA的大致纯度[2]。

1.6 ISSR-PCR扩增选取3组提取的花和叶片基因组DNA，稀释10倍待用。引物：UBC811，序列号(GA)8C。反应体系：每20 μl中含1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl2、0.3 μmol/L 引物、30 ng 模板DNA、0.5 UTaqDNA 聚合酶、dNTP 0.5 μmol/L。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，重复2～4，40个循环；最后72 ℃延伸10 min。

电泳：PCR产物在含EB的2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，以DGL2000DNA作为标准分子量对照。在Gel DocTMEQ凝胶成像仪系统紫外光下拍照[3]。

2 结果与分析

2.1 DNA电泳及紫外检测结果用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测由花和叶所提取DNA的完整性和大致分子量，检测结果见图1和图2。用Varian UV-100紫外可见光分光光度计分别测定波长260 nm和280 nm的光吸收值，根据A260估算样品DNA得率，根据OD260/OD280判断DNA的大致纯度。检测结果见表1。

表1 花与叶提取的DNA产物的纯度和得率

从图1和2可以看出，花基因组DNA条带整齐无拖尾，但条带亮度暗，点样孔亮度高，前者表明DNA浓度低，后者则说明提取的DNA中杂质较多。而叶基因组DNA电泳条带整齐明亮，DNA也十分完整，点样孔亮度较低，表明DNA浓度高且杂质少[4]。

比较花与叶基因组DNA的外观、纯度和得率发现，由嫩叶提取的DNA沉淀干后无色透明，得率最高，为427.6 μg/g，DNA纯度较高，OD260/OD280为1.809。由花提取的DNA浅黄褐色，得率远低于由嫩叶提取的DNA得率，为239.2 μg/g，OD260/OD280只有1.647。其原因可能是蜡梅花瓣内酚类物质浓度高，而在加入65 ℃预热的CTAB提取液700 μl未迅速混匀，在水浴时振荡不够，由此导致酚类物质氧化而呈现黄褐色[5]。

为提高花基因组DNA的浓度与纯度，可将材料研磨得更充分，将其磨细后加入足量提取液摇匀，使待测样品充分分散开，在材料、提取液的混合液较稀薄之后，由肉眼观测可以在提取离心管中流畅流动即可。然后将其放入65 ℃水浴振荡器内，振荡频率设定为300 r/min。经DNA电泳和紫外检测，其结果见图3和表2。

表2 振荡后由花提取DNA产物的纯度和得率

由图3可知，经振荡后花基因组DNA条带整齐明亮，表明DNA浓度较高，但点样孔亮度较高，有少量拖尾，说明提取的DNA中杂质仍较多。由表2可知，经振荡后花基因组DNA得率增加到349.6 μg/g，可见经振荡后提取的DNA浓度明显增加；OD260/OD280也增加到1.767，与叶基因组OD260/OD280也较接近。

针对提取的花基因组DNA中杂质较多的现象，在提取DNA时进行了2次抽提，抽提中，要充分混匀摇动，时间以15 min为宜。2次抽提能去除残留的蛋白质。具体操作方法是在完成1.4中(4)的操作后再回到(3)，其后操作步骤相同。2次抽提后电泳检测结果见图4，紫外检测结果见表3。

由图4可知，经2次抽提后花基因组DNA条带整齐明亮，点样孔亮度也较低，说明提取的DNA浓度较高且杂质少。由表3可知，经2次抽提后由花提取的DNA得率增加到410.3 μg/g，与嫩叶427.6 μg/g的得率非常接近；OD260/OD280也增加到1.798，在(1.8±0.1)的理论值内，说明得到了较纯的花基因组DNA。

表3 2次抽提后花基因组DNA产物的纯度和得率

2.2 ISSR扩增结果选取3组对应花、叶基因组DNA进行ISSR-PCR扩增，PCR产物在含有EB的2.0%琼脂糖凝胶中电泳，结果见图5。由图5可知，花与叶基因组DNA ISSR扩增条带非常接近，主带和特征带在亮度、位置、数量上几乎完全一致。这说明基因组DNA的提取部位不同不会影响ISSR分子标记的结果，这对于形态学分类中以花部形态为主要分

类依据的蜡梅而言，以花作为提取DNA的材料也是较好的选择。

3 结论

在植物的遗传多样性分析中，传统的DNA提取部位多为幼嫩的叶片，但对于蜡梅，尤其是野生种，它们开花季节、生长地点等较为特殊，但有时它们的花又成为形态分类学上重要的因子，直接从花提取DNA就显得更科学和方便，因此笔者对保康野生蜡梅花与叶基因组提取方法的研究表明，对于形态学分类中以花部形态为主要分类依据的蜡梅而言，以花作为提取DNA的材料也是较好的选择，能达到叶基因组的效果。

[1] DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolationp rocedurefo rsm all quantitie of fresh leaf tissue[J].Phytochemical Bulletin，1987，19：11-15.

[2] JOSHI S P，GUPTA V S，AGGARWAL R K，et al.Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter-simple sequence repeat(ISSR)polymorphism in the genus Oryza[J].Theor Appl Genet，2000，100(8)：1311-1320.

[3] 缪恒彬，陈发棣，赵宏波.85个大菊品种遗传关系的ISSR分析[J].园艺学报，2007，34(5)：1243-1248.

[4] 郭春芳.11个茶树品种遗传多样性的ISSR和TRAP比较分析[J].中国农学通报，2008，24(1)：340-346.

[5] 黄文霞，何觉民，朱宏波.蓖麻种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].西北农业学报，2008，17(1)：182-184，187.

Studies on Genomic DNA Extraction Methods of WildChimonanthuspraecoxFlower and Leaf in Baokang Country

YANG Yan-rong

(Journal of Xiangyang Vocational and Technical College, Xiangyang, Hubei 441050)

[Objective] The aim was to confirm thatChimonanthuspraecoxgenomic DNA extracted from the flower was equivalent to extract genomic DNA from the leaf.[Method] Using CTAB methods, genetic diversity of wildChimonanthuspraecoxflower and leaf genome in Baokang County were studied. [Result] When DNA was extracted using CTAB methods, after vibration in 65 ℃ water bath and two extractions, concentration and OD260/OD280value of flower total genome DNA were at similar standard to those of leaf total genome DNA. [Conclusion] DNA extracted from the more significant traitsChimonanthuspraecoxflower genome could reach the level of the leaf genome.

Chimonanthuspraecox；Flower；Leaf；Extraction；Amplification

杨艳容(1974-)，女，湖北枝江人，副教授，硕士，从事湖北保康野生植物资源及应用研究。

2015-02-02

S 188

A

0517-6611(2015)09-033-02