吡格列酮抑制体外高糖培养乳鼠心肌细胞炎症作用的研究

胡 梅，鲍翠玉，骆晓艳

(湖北科技学院，湖北 咸宁 437100)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种独立于冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压性心脏病、心脏瓣膜病及其它心脏病的特异性心肌疾病，它是糖尿病患者常见的心血管并发症之一，与糖尿病患者心力衰竭发生率和死亡率密切相关。现已引起临床医生和流行病学专家高度的重视。目前关于DCM 各方面的报道很多，其确切发病机制不是很清楚，也没统一的治疗方案。高糖血症是引起DCM 的主要病因，研究表明［1，2］，炎症反应在DCM 的发生与发展中起着重要作用。吡格列酮(pioglitazone，PGZ)是临床上常用的一种新型降糖药，研究证明［3］，它不仅能降低血糖而且对组织器官有抗氧化、抗炎等保护作用。目前关于PGZ 对糖尿病心肌的抗炎作用尚少见报道，本实验通过体外培养乳鼠原代心肌细胞，观察PGZ 对高糖培养下的心肌细胞的炎症因子影响，探讨PGZ 对DCM 的保护作用可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康SD 新生大鼠，出生0～3d，雌雄不拘。由武汉大学实验动物中心提供(NO.42000500004462)。

1.1.2 主要实验试剂 PGZ 原粉剂(中国食品药品检定研究院)，DMEM 粉状培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，炎症因子检测ELISA 试剂盒(欣博盛公司)，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物)，单克隆p38 抗体，单克隆磷酸化p38 抗体，单克隆p65 抗体均购自Cell Signaling Technology。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞的培养 取出生0～3d 的乳鼠若干只，用75%的酒精消毒表面皮肤，随后迅速取出心脏并置于4℃预冷的D-Hank’s 液中洗净污血，用眼科剪减去心脏周围的大血管和组织，将心脏剪碎大约1～2mm2大小，用胰酶与Ⅱ型胶原酶混合消化10min，收集上清液，常温下1000rpm，10min 离心，去掉上清，收集离心管下面的沉淀即所得细胞，采用差速贴壁法纯化心肌细胞。最后将细胞接种于含有20% 的胎牛血清DMEM 培养液中，并置于CO2培养箱常规培养。

1.2.2 实验分组及给药方法 将分离的乳鼠原代心肌细胞培养48h 首度换液，倒置显微镜下观察细胞长势，待其细胞长至90%融合时，将细胞分成以下几组并同时给药处理，正常对照组:5.5mmol/L 的葡萄糖DMEM 培养基加25mmol/L的甘露醇;高糖模型组:30mmol/L 的葡萄糖DMEM 培养基;低剂量组:30mmol/L 的葡萄糖的DMEM 培养基加入终浓度为10μmol/L 的PGZ;高剂量组:30mmol/L 的葡萄糖的DMEM 培养基加入终浓度为20μmol/L 的PGZ;以上各组细胞均继续培养48h 后进行以下指标测定。

1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)含量的测定 取培养后心肌细胞的上清液，用LDH 试剂盒检测，严格按照说明书操作，细胞培养液中LDH 的含量作为判断心肌细胞受损程度指标。

1.2.4 炎症因子IL-6 和TNF-α 含量的测定 取培养后心肌细胞的上清液，用ELISA 试剂盒检测，该指标用来判断高糖诱导下心肌细胞内的炎症因子水平的变化。

1.2.5 乳鼠心肌细胞内转录因子NF-κB 的活性检测 分析NF-κB 的活性采用Western blot 检测细胞核内NF-κB p65 蛋白表达量，H3 作为核内参，核蛋白的提取严格按试剂盒说明书操作。

1.2.6 乳鼠心肌细胞内P38MAPK 的蛋白水平测定 采用Western blot 方法分别检测磷酸化蛋白(P-P38)与P38MAPK 蛋白的表达量，并用P-P38/P38 作为判断P38MAPK 的激活状况。

1.3 统计学分析 数据用SPSS 17.0 统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间差异用两样本均数的t 检验进行比较，两组以上比较采用单因素方差分析作统计学处理。P ＜0.05 为差异有显著性，P ＜0.01 为差异有极显著性。

2 结果

2.1 各组细胞培养液中LDH 的含量 在高糖环境下，心肌细胞培养液中LDH、IL-6 和TNF-α 的含量显著上升，而给予PGZ 处理后，能明显的抑制LD、IL-6 和TNF-α 的改变，各组间比较有显著性差异(P ＜0.05)。见表1。

表1 高糖刺激和PGZ 处理对乳鼠心肌细胞培养液中LD、IL-6 和TNF-α 含量的影响

2.2 NF-κB 活性的检测结果 细胞在高糖的诱导下，心肌细胞核内的NF-κB p65 蛋白表达水平明显高于正常组，且差异有显著性意义，经PGZ处理后，能有效的抑制高糖对p65 蛋白表达量改变。见图1。

图1 高糖刺激和PGZ 处理对乳鼠心肌细胞胞核NF-κB p65 蛋白表达量的影响

2.3 乳鼠心肌细胞内P38MAPK 蛋白表达量的结果 高糖组P-P38 相对蛋白量与正常组比较呈明显上升趋势，且两组间差异成显著性，经药物处理后，上述上升的趋势得到有效的逆转。见图2。

图2 高糖刺激和PGZ 处理对乳鼠心肌细胞p38 蛋白表达量的影响

3 讨论

多种机制共同参与了DCM 的病理生理过程，包括氧化应激、炎症反应、心肌细胞凋亡、细胞间质纤维化及左心室肥厚，其中炎症反应与氧化应激起着最上游的级联调控作用［4］。广泛研究证明了在糖尿病心肌组织中可见大量炎症因子水平上升，本实验也发现，乳鼠心肌细胞在高糖的诱导下，培养液中炎症因子IL-6 和TNF-α 的含量明显高于其它组，与此同时，高糖组培养液中LDH 的活性也增加，说明心肌细胞受损引起LDH 外漏，以上表明高糖能诱导原代心肌细胞产生炎症性损伤。

NF-κB 是重要的转录调节蛋白，P50/P65 是其常见的异源二聚体，NF-κB 激活后与抑制蛋白(IKB)解离，从胞浆移至胞核并与其特异的启动子结合来调控相关的基因表达。研究报道［5］它能调控炎症因子:IL-1、IL-6、TNF-α、VCAM-1 等的基因表达。心肌细胞表达促炎因子受体、IL-1、TNFα 及IKK(核因子抑制物激酶)复合体均需要NFκB 信号的活化。体内外研究表明［6］，在糖尿病心肌损伤中可见NF-κB 的活化程度明显的上升。本次实验我们也发现，与正常组对比高糖组心肌细胞核内NF-κB p65 蛋白表达量显著升高，说明在高糖诱导下转录因子被激活后发生了核移位，在核内进一步调控炎症因子的基因表达，致使培养液中炎症因子 IL-1、TNF-α的水平上升。P38MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)参与了多种信号通路的调控，Ulivi 等［7］的研究结果显示，在软骨细胞中P38MAPK 的激活可促进NF-κB 的活化，当给予P38MAPK 特异性抑制剂SB203580 后P38MAPK 和NF-κB 的活化都受到抑制。研究发现［8］p38MAPK 信号通路的激活进能促进IκBɑ(核因子NF-κB 抑制蛋白)磷酸化和降解，从而直接激活NF-κB 通路。而在糖尿病心肌病中对此通路研究甚少，本实验我们发现高糖组心肌细胞的P-P38/P38 比值明显升高，说明该组P38MAPK 通路已明显激活，因此有可能在糖尿病心肌病中通过P38MAPK/NF-κB 这条信号通路来调节心肌细胞中炎症反应。

PGZ 是噻唑烷二酮类降糖药，属胰岛素增敏剂，作用机制与胰岛素的存在有关，可减少外周组织和肝脏的胰岛素抵抗，增加依赖胰岛素的葡萄糖的处理，并减少肝糖的输出。PGZ 除了有降血糖作用外对组织器官还有它保作用，特别是对心肌组织。研究发现，PGZ 能改善心肌左室肥大、心肌纤维化、心室舒张期功能障碍和氧化应激。最近有发现PGZ 有抗炎症作用。刘亭亭［9］等用PGZ 处理炎症性肠病小鼠后，发现与对照组相比小鼠血清中炎症因子TNF-α、C-反应蛋白的水平明显下降。本实验我们发现细胞经PGZ 处理后培养液中 LDH 的活性、炎症因子的含量、P38MAPK 蛋白表达量以及NF-κB 的活化程度都得到有效的逆转，说明PGZ 能保护高糖诱导下心肌细胞的损伤，其保护作用机制可能抑制P38/NF-κB 通路的激活来减少炎症反应的产生，低剂量与高剂量组间没差异，说明PGZ 对心肌细胞的保护成一定的剂量依赖性。

综上所述，高糖可促进心肌细胞的炎症因子的产生增多，并对心肌细胞形成炎症性损伤，PGZ处理细胞后，对高糖下的心肌细胞有明显的保护作用，其作用机制可能与p38MAPK/NF-κB 此条信号通路有关。心肌细胞中的炎症反应能引起多种病理变化，最终导致心力衰竭的发生，严重影响糖尿病患者的生活质量，如果能够抑制心肌细胞的炎症反应，对心肌细胞是一种非常有效的保护方法，将成为临床上治疗DCM新的策略。本实验结果显示，PGZ对高糖诱导的乳鼠心肌细胞的炎症反应有一定的保护作用，这将为临床上开发新一代防治糖尿病心肌病的药物提供了实验依据。

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