UPLC-MS 法测定羊耳菊中6 种成分的含量

侯靖宇，陆 苑，3，潘 洁，兰燕宇，李 春，3，陈思颖，3，王永林，3*

1 贵阳医学院 贵州省药物制剂重点实验室;2 贵阳医学院 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心;3 贵阳医学院药学院，贵阳 550004

羊耳菊又名白牛胆、山白芷，为菊科旋覆花属植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的新鲜或干燥全草，以根或全草入药，具有疏风散热、解毒消肿之功效，收载于《中华本草·苗药卷》、2003 版《贵州省中药、民族药质量标准》［1，2］，为贵州苗族常用药材，民间常用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、风湿疼痛、痈疮疔毒等［3］。近年来对羊耳菊的化学成分研究报道较多，其主要成分有酚类、倍半萜类、有机酸类、黄酮类和挥发油类等［4］，但目前关于羊耳菊的质量研究却较少。《贵州省中药、民族药质量标准》中尚未收载羊耳菊的含量测定项目，经文献查阅，也仅有羊耳菊单一成分及总黄酮测定［5，6］，不能全面反映其内在质量。本课题组前期研究及相关文献报道表明［4］，羊耳菊中东莨菪苷、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸等，具有抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等药理作用［7-13］。UPLC-MS/MS 专属性强，灵敏度高，快速准确，越来越多地应用于中药材质量控制等各方面的研究中［14，15］，因此研究者应用UPLCMS/MS，以葛根素为内标，建立羊耳菊中6 个成分的含量测定方法，为有效控制羊耳菊的内在质量提供了科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY 系统超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1 质谱工作站(美国Waters 公司)。

1.2 材料

东莨菪苷对照品(批号13061442，纯度≥98%)由上海同田生物技术有限公司提供;1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品(均由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心提供，批号分别为1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，纯度≥98%);葛根素和木犀草苷对照品(均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为111-090623、111720-200602，纯度≥98%);甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(德国Merck 公司)、甲酸(美国TEDIA 有限公司)为色谱纯;其他试剂均为分析纯，水为超纯水。羊耳菊药材:共6 批样品，来源于贵州高坡、龙里及罗甸等地，由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为菊科植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液

分别精密称取东莨菪苷等6 种对照品，各置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度处，摇匀。得东莨菪苷(0.504 mg/mL)、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸(1.037 mg/mL)、木犀草苷(0.856 mg/mL)、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸(1.007 mg/mL)、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(0.502 mg/mL)、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(1.073 mg/mL)的储备液。

2.1.2 内标溶液

精密称取葛根素(1.148 mg)，用甲醇定容至10 mL。获得葛根素(0.1148 mg/mL)的储备液。取内标储备液适量至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的内标溶液，置冰箱(-20 ℃)保存，备用。

2.1.3 供试品溶液

取羊耳菊细粉约1.0000 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25 mL，称定重量(精确至0.01 g)，加热回流提取2 h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 mL于蒸发皿，挥干溶剂;残余物转移至25 mL 容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，保护柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);柱温:45 ℃;流速:0.35 mL/min;进样体积为1 μL;流动相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，洗脱程序如下:0～1.0 min，5%～15%(A);1.0～3.8 min，15%～18%(A);3.8～4.0 min，18%～90%(A);4.0～5.0 min，90%～5%(A)。

2.3 质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3 kV，离子源温度120 ℃;去溶剂气N2，流速650 L/h，去溶剂气温度350 ℃，离子源温度120 ℃;碰撞气Ar，流速0.16 mL/min。扫描方式为多反应离子监测(MRM)，监测离子见表1。

表1 质谱条件Table 1 MRM conditions for the 6 compounds

2.4 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液适量并加入内标(葛根素)溶液，15000 rpm，离心5 min 取上清液1 μL 进样，结果见图1。由图可见，被测定成分间分离良好，未有杂质干扰，比较供试品溶液和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，表明本法专属性良好。

图1 混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 图谱Fig.1 MRM total ion chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.5 线性试验

精密吸取“2.4”项下制备的混合对照品溶液适量，依次稀释，制得6 个浓度的系列浓度线性工作液，分别进样测定。以对照品浓度(c)为横坐标X，色谱峰面积与内标峰面积比值(A/Ai)为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程见表3。

表2 6 种成分的线性关系Table 2 Linear relationships of 6 investigated compounds

2.6 重复性试验

取同批次羊耳菊药材，按“2.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算得1～6 平均含量分别为0.211、2.083、0.036、2.573、0.087 和0.233 mg/g，RSD 分别为5.27%、4.24%、3.16%、1.51%、1.53%和2.96%，表明本方法重复性良好。

2.7 精密度试验

取与重复性一致的同一批号的供试品溶液，连续测定3 d，每天进样6 次，依据内标法计算含量，结果1～6 的日内及日间精密度(n=6)RSD 分别为1.02%～3.31%和1.35%～3.11%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别处理后于0、2、4、8、12 h 进样分析，1～6 含量的RSD 分别为1.94%、1.54%、3.49%、1.87%、2.83%，5.79%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取6 份已知含量的羊耳菊样品适量，平均分为3 组，分别精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合对照品溶液(1～6 浓度分别为0.042、0.130、0.063、0.210、0.126、0.134 mg/mL)，制成低、中、高浓度的质控样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述条件进样测定，计算加样回收率，结果表3。

表3 回收率实验结果(%，n=3)Table 3 Results of recovery(%，n=3)

2.10 样品测定

按“2.1.3”项下方法制备6 批样品的供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算样品中各成分的含量，结果见表4。

表4 6 批样品中6 个成分的含量(mg/g，n=3)Table 4 Content determination results of 6 compounds from six batches of I.cappa sample(mg/g，n=3)

3 讨论与结论

UPLC 使用1.7 μm 颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率，UPLC-MS/MS 法在不影响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度。本研究首次建立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS 法，在6 min 内即可同时准确测定羊耳菊中6 个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。

实验中考察了以甲醇、无水乙醇、25% 乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水为提取溶剂，分别用索氏提取、回流提取和超声处理，以及不同时间对羊耳菊进行提取，对测定结果综合分析后，最后采用25%乙醇加热回流提取2 h，6 种成分的提取效率较好。

通过贵州不同产地的6 批羊耳菊药材含量测定结果可以看出，羊耳菊中6 种成分的含量存在明显差异，其中贵州龙里产的药材含量较高，说明生态环境、采收时间和储存条件等可能对含量产生影响。上述结果提示，为保证羊耳菊相关制剂批次间质量的一致性，应加强羊耳菊的质量控制，必要时固定药材的来源。

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