响应面法优化马兰总三萜提取工艺研究

王国凯，王 诤，蔡百祥，高卫娜，刘劲松，王 刚

安徽中医药大学药学院 现代中药安徽省重点实验室，合肥 230012

马兰［Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip］为菊科马兰属植物［1］，具有凉血、清热、利湿、解毒等功效［2］。临床使用马兰治疗乙肝的临床多有报道，且疗效显著［3，4］。三萜类化合物是广泛存在于中药中的一类化合物，多数三萜由30 个碳原子组成。研究表明三萜类化合物具广泛的生物活性，具有较强的抗炎、抗菌、抗肿瘤等生物活性［5］，在前期研究的基础上［6］，本实验旨在运用响应面法优选马兰最佳提取工艺，继而最大限度提取马兰总三萜，保证能充分利用马兰药材资源，提高经济效益，为研究开发马兰提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

马兰全草2013年购自安徽亳州药材市场，标本经中药标本中心杨青山老师鉴定为菊科马兰属植物马兰;齐墩果酸(批号:110709 -201311)购自阿拉丁试剂有限公司;其它试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

UV757CRT 紫外可见分光光度计(岛津);AG-285 型十万分之一电子天平(赛多利斯);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅)。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品10.07 mg，用90%乙醇定容至50 mL，制成0.2014 mg/mL 的溶液作为对照品溶液。

2.2 标准曲线的绘制

分别吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于试管中，水浴蒸干，分别加入新配制的5 %香草醛-冰醋酸0.2 mL 和高氯酸1.2 mL，摇匀后，置于70 ℃水浴加热15 min，冷却至室温，加乙酸乙酯3.6 mL，随行试剂做空白，波长550 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。回归方程y=48.619x-0.0742(r=0.9983)。

2.3 供试品溶液的制备及含量测定

精确称取马兰提取物0.1 g，用90%乙醇定容至50 mL 容量瓶中超声至完全溶解。取2 mL 溶液，用90%乙醇定容至10 mL 容量瓶，摇匀。取供试品溶液1 mL 于试管中，85 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛冰醋酸(5g 香草醛用冰醋酸溶解后，定容至100 mL)0.2 mL，高氯酸1.2 mL，放至70 ℃水浴中加热15 min。取出流水冷却至室温，加乙酸乙酯3.6 mL，随行试验做空白［7，8］。用紫外分光光度计波长550 nm 处测定，代入回归方程供试品中马兰总三萜的含量。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇浓度考察

称取药材50 g 各五份，以提取时间为1.5 h，提取次数为3 次，料液比为1∶15 g/mL，乙醇浓度分别以40%、50%、60%、70%、80%回流提取。

2.4.2 料液比考察

称取药材50 g 各五份，以提取时间为1.5 h，提取次数为3 次，料液比分别以1 ∶9、1 ∶12、1 ∶15、1∶18、1∶21 g/mL 50%乙醇回流提取。

2.4.3 提取时间考察

称取药材50 g 各五份，料液比为1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取次数为3 次，提取时间分别以0.5、1、1.5、2、2.5 h 进行回流提取。

2.4.4 提取次数考察

称取药材50 g 各五份，料液比为1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取时间为1.5 h，提取次数分别以1、2、3、4、5 次进行回流提取。

2.5 响应面法优化马兰总三萜的提取工艺

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理［9，10］，选出影响马兰总三萜取率的四个主要因素:乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)，进行这四个因素三水平的响应面分析试验，考察目标为总三萜提取率。采用Design-Expert 8.0.5b 软件对数据进行分析处理。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levers of RSM analysis

图1 乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)及提取次数(D)对马兰总三萜的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid/liquid ratio (B)，ultrasonic duration (C)and times of extraction (D)on the yield of total triterpenes

3 实验结果

3.1 单因素试验结果

单因素试验考察结果可知50%乙醇、1∶15 g/mL、提取1.5 h、提取3 次提取最佳。

3.2 响应面结果

以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为自变量，以得率(Y)为响应值，用Design-Expert 8.0.5b 软件进行四因素三水平的响应面分析实验结果。

表2 响应面分析实验结果Table 2 The result of response surface design

对以上中心组合数据进行处理，可得到二次响应面的回归方程为:Y=+0.024-1.541E-003 ×A +3.869E-004 ×B+2.938E-004 ×C+2.493E-003 ×D-3.825E-004 ×AB +1.087E-003 ×AC-1.366E-003 ×AD-1.892E-004 ×BC-1.821E-004 × BD-1.395E-003×CD-2.454E-004 ×A2-2.501E-004 ×B2 +2.577E-004 ×C2-2.527E-003 ×D2

由回归方程可知，对马兰总三萜提取率的影响大小顺序为:提取次数＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间。对该方程进行回归分析。

表3 回归分析结果Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model

结果表明A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2因素对马兰总三萜的提取率影响显著，表明四个因素均有显著的影响;其中AB、AC、CD 显著表明在提取过程中乙醇浓度和料液比，乙醇浓度和提取时间，提取时间和提取次数的交互作用也会对马兰总三萜提取率带来显著影响。进一步分析方程方差可知，由总模型P＜0.001 可知本实验所选取的二次多项式模型具有高度的显著性;失拟项为0.8812＞0.05，故失拟项不显著;决定系数R2=0.9959，校正决定系数R2Adj=0.9919，结果说明模型可以解释响应值的变化，说明拟合度较好，可以采用此模型对马兰总三萜的提取工艺进行优化。

3.3 响应面图与等高线图分析

图2A～D 是根据多元回归方程得到的四个因素对马兰总三萜提取率影响的响应面图及等高线图。图2A 显示了乙醇浓度与料液比对马兰总三萜得率的交互作用，由图可知，等高线呈椭圆形，说明乙醇浓度和料液比之间的交互作用显著。图2B 显示了乙醇浓度与提取时间对马兰总三萜得率的交互作用，由图可知，等高线呈椭圆形，说明乙醇浓度与提时间之间的交互作用显著。图2C 显示了乙醇浓度与提次数对马兰总三萜得率的交互作用，由图可知，等高线呈椭圆形，说明乙醇浓度与提次数之间的交互作用显著。图2D 显示了提取时间与提次数对马兰总三萜得率的交互作用，由图可知，等高线呈椭圆形，说明提取时间与提次数之间的交互作用显著。

3.4 验证性试验

图2 各交互作用对马兰总三萜影响的响应曲面Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total triterpenes

通过数据分析，可得到马兰总三萜提取的最佳工艺为:乙醇浓度40%;料液比1∶18 g/mL;提取时间1 h;提取次数3.98 次。在此条件下，马兰总三萜提取率的理论值为2.83758%。综上考虑:提取次数为4 次。验证性试验在此条件下平行提取3 次，测得实际提取率均值为2.68%。

4 结论

本次实验通过运用响应面法设计优化马兰总三萜的最佳提取工艺为乙醇浓度40%，料液比1∶18 g/mL，提取次数4 次，提取时间1 h。经最佳工艺得到的马兰总三萜的含量为26.83 mg/g。

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