HPLC 同时测定延胡索中6 个核苷成分含量

陈东东，陈亚运，周 萍，李 祥，陈建伟

南京中医药大学，南京 210023

延胡索来源于罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang 的干燥块茎，是著名的“浙八味”中的一种。始载于《神农本草经》，列为中品，味辛、苦，性温。具有活血，利气，止痛等功效，用于治疗胸肋、脘腹疼痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛［1］等症。本品为中国药典所载常用中药，全国多地区有分布，主产于江苏、浙江等地。现代研究发现，延胡索对心血管系统、神经系统等药理作用明显，临床应用较为广泛，用量较大。核苷是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA 代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性［2］。如腺苷具有改善心脑血液循环，防止心律失常，抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等［3，4］。目前在延胡索质量评价方面，大多以延胡索乙素等生物碱的含量为指标，而关于核苷类成分的含量测定，笔者尚未见到相关文献报道。本实验通过参照其他有关核苷成分含量测定的相关报道，对延胡索中6 种核苷成分进行了定性、定量分析，为延胡索的化学成分、药理作用，和多指标质量控制提供了科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪:包括Waters2489型PDA 检测器，Empower 工作站(Waters 公司);AG285 电子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-2200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);纯水仪(南京易普易达科技发展有限公司)。

1.2 试药

对照品胞苷(批号0001446223)、尿苷(批号100469-200401)、腺苷(批号140709-200602)、2-脱氧腺苷(批号20331-201208)、鸟苷(批号20332-201205)、胸苷(批号140661-200301)购自Sigma 公司;三批延胡索购自江苏宜兴、江苏南通、浙江杭州，经本校中药资源教研室陈建伟教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang 干燥块茎;甲醇、磷酸为北京化工厂产品;水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Grace Prevail C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱;以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱为:(0～15min，0.5%～7%甲醇;15～25min，7%～15%甲醇;25～35min，15%～80% 甲醇;35～45min，80%～90%甲醇);流速0.8 mL/min;柱温30 ℃;检测波长260 nm;进样量均为10 μL。

2.2 对照品和供试品溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取胞苷、尿苷、腺苷、2-脱氧腺苷、鸟苷、胸苷的对照品适量，用10%的甲醇溶液配制成质量浓度分别为607.3、908.4、967.6、210.6、679.7、256.3 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

延胡索研成粉末，过60 目筛，精密称取1.0 g，置50 mL 锥形瓶中，精密量取10%甲醇10 mL，称定重量，超声(500 W，40 kHz)处理30 min，冷却至室温，称重，用10%甲醇补足减失重量，过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验

在“2.1”项色谱条件下，混合对照品溶液和延胡索供试品溶液的色谱图见图1，混合对照品溶液及延胡索供试品溶液中6 种核苷达到基线分离。

图1 混合对照品(A)和供试品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and C.yanhusuo sample (B)

2.3.2 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 至10 mL 容量瓶中，加10%甲醇定容至刻度，离心后取10 μL 注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行分析，以峰面积Y 对进样量X 进行回归计算，回归方程见表2。

表1 被测核苷的线性关系和线性范围Table 1 Linear ranges and regression equations of studied nucleosides

2.3.3 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别连续进样测定6 次，测定6 种核苷的峰面积并计算其RSD。结果显示胞苷、尿苷、腺苷、2-脱氧腺苷、鸟苷、胸苷的RSD 分别为1.2%、0.5%、0.6%、1.0%、1.3%、0.8%，符合精密度要求。

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品(浙江杭州)溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、20 h 进样10 μL，测定6 种核苷的峰面积并计算RSD。结果显示胞苷、尿苷、腺苷、2-脱氧腺苷、鸟苷、胸苷的RSD 分别为0.9%、1.4%、1.6%、1.2%、1.8%、1.3%，表明供试品溶液在20 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验

取同一批次(浙江杭州)样品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算含量及RSD。结果胞苷、尿苷、腺苷、2-脱氧腺苷、鸟苷、胸苷的平均含量分别为21.36、207.85、222.35、8.45、154.83、11.54 μg/g，RSD 分别为1.3%、1.7%、0.9%、1.8%、1.0%、1.2%，表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已知含量的样品(浙江杭州)1.0 g 共6 份，按1:1 的比例加入适量对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样分析，根据测得量和加入量计算其回收率，结果见表3。

表3 样品加样回收率试验(n=6)Table 3 Results of recovery tests(n=6)

2.4 样品含量测定

取不同产地延胡索粉末1.0 g，平行3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样分析，采用外标法计算含量，取3 份平均值，结果见表4。

表4 样品中6 种核苷的含量(n=3，μg/g)Table 4 Contents of six compounds in samples (n=3，μg/g)

3 讨论

3.1 提取方法的选择

通过查阅相关文献［5-7］，分别对延胡索样品提取的方法包括超声提取和加热回流提取、提取溶剂分别考察了20%甲醇、15%甲醇、10%甲醇、水，提取溶剂的用量分别考察了10、20、40、80 mL 和提取时间20、30、50、60、90 min，等因素进行了考察。结果显示热回流和超声所得供试品中差异不大，但超声更加简捷，快速，容易制得，故选择超声的提取方法，另外提取溶剂中发现10%甲醇提取的效果较好，几种核苷成分的含量较高，并同时确定了提取时间30 min 较适宜，料液比1∶10 为最佳提取条件。

3.2 色谱条件的优化

核苷类成分大多溶于水，偏碱性，所以流动相的条件着重考虑了甲醇-水［8］，乙腈-水［9］，甲醇-酸水［10］系统，最后试验发现选用甲醇-0.1%的磷酸水为流动相时的峰形较好，分离度较高。另外，并对样品做全波长扫描，发现样品在254 nm 和267 nm 处有最大吸收，参照相关文献发现大多在260 nm 处测定核苷成分的含量，发现在260 nm 处，延胡索中6种核苷也都有较好的吸收，峰形较好，分离度较高，故选择260 nm 作为检测波长值。

3.3 不同产地延胡索中核苷含量的差异

从表4 中可看出南通、宜兴、浙江三个产地中，腺苷和尿苷的含量较高，且远高于其他4 种，其中又以腺苷含量居首，而2-脱氧腺苷的含量为最低。造成不同核苷成分的含量的差异可能跟当地气候条件，土壤情况，以及采收时期有关，值得深入研究，以便能更好了解延胡索化学成分的差异，更好的控制延胡索质量。

1 Lu CM(鲁春梅)，Zhang CS(张春森)，Jiang LY(姜立勇).Research progress on chemical and pharmacological effects of Corydalis Rhizoma.TCM Mod Study Appl(中药现代研究与应用)，2011，5:126-127.

2 Zhang WM(张文萌)，Jia YR(贾玉荣)，Fu JN(付锦楠).RP-HPLC simultaneous determination of five nucleoside in Rehmanniae Preparata Radix.J Pharm Anal(药物分析杂志)，2013，33:94-97.

3 Li J(李静)，Zhu JY(朱静毅).Research progress on determination of nucleoside.Tianjing Pharm(天津药学)，2013，25(6):53-55.

4 Lv AJ(吕爱娟)，Wu H(吴皓).Research on components of nucleoside in traditional Chinese medicine.Chin J Inf Tradit Chin Med (中国中医药信息杂志)，2006，13(7):94-97.

5 Zhong QX(钟倩霞)，Lv GP(吕广萍)，Peng L(彭亮)，et al.HPLC determination of 4 nucleoside in Dictyophora echinovolvata from different places of production.J Pharm Anal(药物分析杂志)，2014，34:411-414.

6 Li F(李峰)，Jing H(姜泓)，Kang TG(康廷国).Analysis of nucleoside in Lubian commercial medicinal materials.Chin Tradit Patent Med(中成药)，2009，31:1254-1257.

7 Li XL(李雪玲)，Cui XM(崔秀明)，Dai Y(戴云).Determination of guanosine in Pinellia ternata from the different habitats and the processed.Chin J Spectro Lab(光谱实验室)，2006，23:220-223.

8 Zhang HJ(张海娟)，Ma SZ(马世震)，Xiao YC(肖远灿).RP-HPLC simultaneous determination of ten nucleosides and nucleosides in Fritillaria unibracteata.J Pharm Anal(药物分析杂志)，2013，32:986-989.

9 Liu R(刘睿)，Ma SM(马思萌)，Sun L(孙璐).Simultaneous determination of ten nucleoside components in Kudiezi Injection by HPLC-DAD.Chin Tradit Herb Drug(中草药)，2013，44:2542-2546.

10 Tian XR(田晓然)，Fu TM(付廷明)，Guo LW(郭立玮).HPLC simultaneous determination of five nucleoside components in extracts of Buthus martensii by different extraction technologies.Chin J Exp Tradit Med Form (中国实验方剂学杂志)，2013，19(8):13-16.