蚯蚓谷胱甘肽还原酶分离提取的研究

原 琳，李 娇，王有志，荣永海，荣 龙

北京航天航空大学生物与医学工程学院，北京 100191

蚯蚓(Eisenia fetida)属环节动物门寡毛纲类单向蚓目，具有水解碳水化合物和蛋白质的能力，可消化土壤中的落叶、褐藻、真菌等［1］。目前，对蚯蚓的研究主要集中在其与土壤的相互作用方面［2-4］，而蚯蚓体内所含有的多种抗氧化酶未被充分开发利用。本实验室已完成了蚯蚓过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的分离提取研究［5，6］，此外，蚯蚓中还含有大量的谷胱甘肽还原酶。

谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase GR∶EC 1.6.4.2)是一种重要的黄素蛋白酶，广泛存在于动、植物以及微生物中。GR 的分子量为60～65 kDa，等电点(isoelectric point，pI)为4.5。GR 为谷胱甘肽氧化还原系统的重要组成部分，可利用还原型辅酶II(NADPH)将氧化型谷胱甘肽(GSSG)转变为还原型谷胱甘肽(GSH)，以补充GSH 在氧化应激状态下的不断消耗，使细胞内GSH 与GSSG 的比值维持在一个固定水平(GSH/GSSG=100/1)。同时，GR 还可与超氧化物歧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及过氧化氢酶共同作用，清除体内的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)［7］，共同构成机体的抗氧化系统。当植物受到环境胁迫时(包括空气污染、强光、干旱、γ-射线、冷胁迫、热胁迫、高压氧胁迫以及重金属等)，体内会产生活性氧，GR 酶活性就会相应升高，以抵抗氧化损伤。

闪式提取是一种新型的提取方法，其利用机械剪切力和超动分子渗滤作用，可在极短时间内使目标提取物从细胞中释放出来，是一种高效节能的提取方法。此外，由于闪式提取在常温下操作，不会使生物活性物质受热破坏，因此，适合用于酶类的分离提取。本研究创新性地将其应用于GR 的提取分离。

目前，GR 的提取分离研究主要集中于植物，而蚯蚓中GR 的研究还未见报道。本研究利用闪式提取与超声提取相结合的方法对蚯蚓中的谷胱甘肽还原酶进行了提取纯化，并对其性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜冻蚯蚓购自北京大环顺鑫有机肥料厂;DEAE Sepharose Fast Flow 琼脂糖凝胶层析柱由GE Healthcare 生产;氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione oxidized，GSSG)购自北京拜尔迪生物技术有限公司;还原型辅酶II 四钠(NADPH Na4)由德国Roche 公司生产;考马斯亮蓝G-250 由美国Amresco 公司生产;SDS 聚丙烯凝胶电泳试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

电子天平，意大利BEL Engieering srl 公司;JHBE-50 型闪式提取器，河南金鼎科技发展有限公司;SY-1000E 型多用途恒温超声提取机，北京弘祥隆生物技术开发有限公司;900 型低温冰箱，Thermo Scientific 公司;HH-4 型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;ArantiTMJ-25 型低温离心机，美国Beckman Coulter 公司;3000 型分光光度计，美国BIO-RAD 公司;DYY-7C 型电泳仪，北京市六一仪器厂;211 型pH 计，意大利HANNA 公司。

1.3 谷胱甘肽还原酶活性的检测

谷胱甘肽还原酶的活性利用其催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)及还原型辅酶II(NADPH)的性质来测定，采用杨伟宗等［8］的方法。酶活性单位定义为每分钟消耗1 μmol NADPH 的GR 酶量。

1.4 蛋白质浓度的测定

蛋白质浓度由Bradford 法测定，使用牛血清白蛋白作为蛋白标准品绘制标准曲线。标准曲线为A=0.0082 +0.0061C，R2=0.9992。

1.5 蚯蚓谷胱甘肽还原酶提取纯化的工艺

蚯蚓谷胱甘肽还原酶的提取与纯化工艺见图1。

图1 蚯蚓谷胱甘肽还原酶提取纯化工艺流程Fig.1 Extraction and purification process of earthworm GR

1.6 粗酶液的制备

称取100 g 新鲜冻蚯蚓，剪碎。加入4 倍体积缓冲液A(pH 8.0，含5 mmol/L EDTA 的5 mmol/L PBS 缓冲液)，以3500 r/s 闪提60 s，再以800 W 功率超声提取30 min。后在-70 ℃冷冻12 h，融化后以11000 r/s 离心40 min，弃去沉淀，上清液即为蚯蚓GR 粗酶液。

1.7 谷胱甘肽还原酶提取条件的优化

1.7.1 闪式提取单因素试验

取700 g 蚯蚓平均分成7 份，分别加入4 倍体积pH 值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，含5 mmol/L EDTA 的5 mmol/L PBS 缓冲液，以3500 r/s闪提60 s，再以800 W 功率超声提取30 min。之后在-70 ℃冷冻12 h，融化后以11000 r/s 离心40 min，弃去沉淀，分别测上清液中的GR 酶活，以考察闪提pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)对蚯蚓GR提取总酶活的影响。

取600 g 蚯蚓平均分成6 份，分别按料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 加入不同体积的缓冲液A，以3500 r/s 闪提60 s，再以800 W 功率超声提取30 min。后在-70 ℃冷冻12 h，融化后以11000 r/s离心40 min，弃去沉淀，分别测上清液中的GR 酶活，考察闪提料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)对蚯蚓GR 提取总酶活的影响。

取500 g 蚯蚓平均分成5 份，各加入4 倍体积缓冲液A，分别以3500 r/s 闪提30、45、60、75、90 s，再以800 W 功率超声提取30 min。后在-70 ℃冷冻12 h，融化后以11000 r/s 离心40 min，弃去沉淀，分别测上清液中的GR 酶活，考察闪提时间(30、45、60、75、90 s)对蚯蚓GR 提取总酶活的影响。

1.7.2 超声提取单因素试验

取600 g 蚯蚓平均分成6 份，各加入4 倍体积缓冲液A，以3500 r/s 闪提60 s，再以800 W 功率分别超声提取0、15、30、45、60、75 min。后在-70 ℃冷冻12 h，融化后以11000 r/s 离心40 min，弃去沉淀，分别测上清液中的GR 酶活，考察超声时间(0、15、30、45、60、75 min)对蚯蚓GR 提取总酶活的影响。

1.7.3 正交试验

选取单因素试验中对蚯蚓GR 总酶活影响较大的因素设计正交试验，以进一步优化蚯蚓GR 的提取条件。

1.8 谷胱甘肽还原酶的纯化

向粗酶液中缓慢加入3 倍体积丙酮(-20 ℃预冷)，在-20 ℃下静置1 h。以11000 r/s 离心40 min，收集上清留待回收丙酮，用适量缓冲液A 溶解沉淀。向溶液中缓慢加入硫酸铵至饱和度达到30%，在4 ℃下静置2 h。以11000 r/s 离心40 min，取上清，在4 ℃下对缓冲液A 透析2 h。将透析后的酶液过预先用缓冲液A 平衡的琼脂糖凝胶层析柱(2.5 cm × 30 cm)。用含0.5 mol/L NaCl 的缓冲液A 洗脱，收集洗脱液，即为纯化的GR 酶液。

1.9 谷胱甘肽还原酶分子量的测定

谷胱甘肽还原酶的分子量由SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。蛋白质条带用考马斯亮蓝R-250 染色。

1.10 pH 值和温度对酶活性的影响

分别在不同的pH 值下测定GR 的活性，其余条件同标准测定方法，以研究GR 的最适pH 值。采用一系列缓冲液配制不同pH 值的检测体系以测定最适pH 值，包括氯化钾-盐酸缓冲液(pH 值2.0)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 值3.0～5.0)、PBS 缓冲液(pH 值6.0～8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH值9.0～10.0)及碳酸钠-氢氧化钠缓冲液(pH 值11.0)，缓冲液浓度均为0.1 mol/L。将纯化的GR酶液分别调至上述pH 值，在37 ℃下水浴2 h，之后用标准检测方法测定其剩余活性，以研究GR 的酸碱稳定性。

GR 的最适温度利用标准方法分别在20～80℃下测定。将纯化后的GR 酶液分别在20～80 ℃下水浴2 h，再以标准测定方法测该酶剩余活性，以研究GR 的热稳定性。

2 结果与讨论

2.1 GR 提取条件的优化结果

2.1.1 闪式提取单因素试验结果

闪提pH 值对蚯蚓GR 提取率的影响见图2。pH 值由6.0 逐渐增大时，所提取的蚯蚓GR 总酶活也随之逐渐增加，pH 增大到7.5 时，GR 的总酶活达到最大。随着pH 值继续增大，GR 的总酶活逐渐降低。因此，选择pH 7.5 作为闪提最佳pH 值。

图2 闪提pH 值对谷胱甘肽还原酶总酶活的影响Fig.2 Effect of pH on the total activity of GR

闪提料液比对蚯蚓GR 提取率的影响见图3。加水倍数由2 倍开始增加，提取剂比例的增大使蚯蚓细胞内的物质释放更加充分，所提取的蚯蚓GR总酶活也随之增加，当料液比达到1∶5 时，蚯蚓GR的总酶活达到最大值。之后，随着加水比例的增大，GR 的总酶活反而呈下降趋势，可能是原料被提取剂过度稀释后，闪提的机械剪切机会减少，使得提取效率降低。另外，加水过多，使提取出的GR 被稀释，提取液的离子强度降低，导致GR 失活。综上，选择1∶5 作为闪提最佳料液比。

图3 闪提料液比对谷胱甘肽还原酶总酶活的影响Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on the total activity of GR

图4 闪提时间对谷胱甘肽还原酶总酶活的影响Fig.4 Effect of extraction time on the total activity of GR

闪提时间对蚯蚓GR 提取率的影响见图4。闪提时间由30 s 增加到45 s 时，蚯蚓GR 总酶活显著增大，但闪提时间继续增加，GR 总酶活基本保持不变。因此，选择45 s 作为最佳闪提时间。

2.1.2 超声提取单因素试验结果

超声时间对蚯蚓GR 提取率的影响见图5。超声波可将细胞破碎，随着超声时间的增加，蚯蚓GR总酶活也随着增加，在15 s 时，GR 总酶活达到最大值。但是，超声时间超过30 s 后，GR 总酶活反而随超声时间的增加而下降，这可能是由于超声波的辐射及热能作用于酶蛋白，会使其结构发生改变，导致酶失活。综上，选择15 s 作为最优超声时间。

图5 超声时间对谷胱甘肽还原酶总酶活的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on the total activity of GR

2.1.3 正交试验结果

根据单因素实验的结果，选择pH 值、料液比及超声时间这个对提取率影响较大的因素设计正交试验，各因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

正交试验的结果见表2。由结果可知，各因素的最优组合为A2B2C3，即最优条件为:pH 值7.5，料液比1∶5，超声时间25 min。由极差分析可知，各因素对蚯蚓GR 总酶活的影响大小顺序依次为B ＞A ＞C。

表2 正交试验结果Table 2 Results of L9(34)experimental design for the extraction of GR

正交试验的方差分析结果见表3。由离差平方和可知，对GR 总酶活影响大小依次为B ＞ A ＞C，与正交试验的结论一致。其中，闪提料液比对蚯蚓GR 提取率的影响显著(P＜0.05)，其次为闪提pH 值(P＜0.10)，而超声时间对GR 提取率的影响不显著，因此，为节约能源，选择最低水平15 min 作为最优超声时间。

综合以上分析，确定蚯蚓GR 提取的最优工艺条件为:pH 值7.5，料液比1∶5，超声时间15 min。

表3 方差分析Table 3 ANOVA of the GR extraction

2.2 谷胱甘肽还原酶的纯化结果

利用上述最优条件得到的蚯蚓GR 提取纯化结果见表4。最终，从蚯蚓中提取的谷胱甘肽还原酶纯化了32.3 倍，回收率达到58.4%。其他来源的GR 与蚯蚓GR 的比较情况见表5。经比较可知，从蚯蚓中提取纯化的GR 具有更高的比活力，且用本研究所确定的提取方法能够保证相对较高的回收率，同时蚯蚓生物量极大，更易获得。因此，蚯蚓GR 更适合于工业化生产。

表4 蚯蚓谷胱甘肽还原酶纯化结果Table 4 Purification results of GR

表5 其他来源的谷胱甘肽还原酶与蚯蚓谷胱甘肽还原酶提取分离情况比较Table 5 Comparison of purification of GR from earthworm with GR from other sources

2.3 SDS-PAGE 测定分子量结果

各步骤酶液的SDS-PAGE 电泳结果见图6。粗酶液中的大部分杂蛋白经丙酮沉淀及硫酸铵沉淀去除，而经过DEAE-Sepharose 柱后，蚯蚓GR 被纯化至单一条带。与Marker 进行对照，可知蚯蚓GR 的分子量大约为110 kDa。

图6 蚯蚓谷胱甘肽还原酶的SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.6 SDS-PAGE pattern of the purified GR

图7 蚯蚓谷胱甘肽还原酶的最适pH 值及酸碱稳定性Fig.7 Effects of pH on the activity and stability of earthworm GR

2.4 谷胱甘肽还原酶的最适pH 值及酸碱稳定性结果

pH 值对蚯蚓GR 活性的影响如图7 所示。GR在pH 8.0 时相对酶活具有最大值，此与绵羊肝脏GR 的最适pH 相一致。在不同pH 值下水浴2 h后，GR 酶活在pH 6.0～8.0 之间可保持最大活性的85%以上，而在pH 3.0 以下，GR 完全失活。

2.5 谷胱甘肽还原酶的最适温度及热稳定性

温度对蚯蚓GR 活性的影响如图8 所示。温度在50 ℃时，蚯蚓GR 具有最大酶活性。这与孙虎山等［9］对栉孔扇贝血液中GR 的研究结果相同。温度在40 ℃以下时，水浴2 h 后蚯蚓GR 活性基本可保持稳定。50 ℃以上，GR 稳定性迅速下降，2 h 后仅剩50%。60 ℃以上水浴2 h 后，GR 活性完全丧失。

图8 蚯蚓谷胱甘肽还原酶的最适温度及热稳定性Fig.8 Effects of temperature on the activity and stability of earthworm GR

3 结论

本研究实现了利用闪式提取与超声提取相结合的方法从蚯蚓中提取纯化GR，并对GR 的性质进行了研究。纯化得到的GR 分子量为110 kDa。蚯蚓GR 的最适pH 及温度分别为8.0，50 ℃。利用蚯蚓提取纯化的GR 比活力及收率与其他来源的GR 相比均较高，且蚯蚓较其他原料更易获取，因此，蚯蚓是生产GR 的一种较好来源。本研究确立了一种高效的GR 提取分离方法，为未来GR 的产业化生产创造了条件。

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