环巴胺类似物的合成及体外抗肿瘤细胞活性研究

郑晓红，管童伟，韩旭然，王世盛，赵伟杰

大连理工大学制药科学与技术学院，大连 116023

Hedgehog(Hh)信号通路的紊乱及其信号相关成分的突变可导致多种肿瘤的发生及发展［1］。近年来，Hh 信号通路抑制剂在国内外引起了广泛的关注及研究，有望成为肿瘤治疗的新靶点。

环巴胺(Cyclopamine，2)作为特异性Hh 通路抑制剂，对包括基底细胞瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤均有显著的抑制活性［2-4］。然而，环巴胺的水溶性和稳定性都很差，在植物中的含量极低，严重限制了临床应用。目前，针对环巴胺类似物的研究大多集中于对D 环进行扩环的结构修饰，其中IPI-926 显示了较好的稳定性与药代动力学性质［5，6］，目前已进入Ⅱ期临床实验阶段。但以环巴胺为原料的半合成仍然受原料来源困难、价格昂贵的限制，临床应用仍有一定困难。

介芬胺(Jervine，1)为环巴胺的11-氧代衍生物，在藜芦中含量较高。两者虽然结构相似，但介芬胺的抗肿瘤活性明显弱于环巴胺。为研究环巴胺类甾体生物碱抗肿瘤作用的构效关系，本文以来源较为丰富的介芬胺为原料进行结构修饰，合成环巴胺类似物并进行体外抗肿瘤活性研究。由于11 位羰基对该类生物碱的抗肿瘤活性有显著影响，本文首先采用不同的还原剂对介芬胺的α，β-不饱和酮进行了选择性还原［7，8］，得到环巴胺等3 种还原产物;其次，采用氧化及甲基化反应对3 位羟基和哌啶环的胺基进行修饰，合成了6 种衍生物。运用MTT 法研究了介芬胺及其衍生物对人胰腺癌Aspc-1 和人胃癌SGC-7901 细胞体外增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

介芬胺(纯度＞98%，由本实验室从藜芦中提取);Aspc-1 人胰腺癌细胞和SGC-7901 人胃癌细胞(由大连医科大学药学院提供，由我室传代保存);DMEM 培养液(Gibco 产品);四甲基唑氮蓝(Sigma公司产品);二氧化碳培养箱(Hera Cell 150);酶标仪(Synergy H1);倒置显微镜(Olmpus 1X71);核磁共振波谱仪(AVANCE Ⅱ400)。

图1 介芬胺的选择性还原Fig.1 The selective reduction of jervine

1.2 介芬胺α，β-不饱和酮的选择性还原

化合物2 称取40 mg 介芬胺于25 mL 三口瓶中，加入5 mL 一缩二乙二醇，80%水合肼600 μL，120 mg NaOH，油浴加热至160 ℃，回流4 h，减压蒸馏除尽水分和残余的水合肼。600 W，200 ℃下，微波反应4 h。薄层检测反应终止后，自然冷却至室温。后处理:加入5 mL 水，氯仿萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏回收溶剂得粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱剂比例为氯仿∶石油醚∶三乙胺=1∶7∶0.1，得固体15 mg。白色无定型粉末，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 410［M+H］+，分子式为C27H41NO2。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:0.96(3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.97(3H，d，J=1.7 Hz，H-27)，1.09(3H，s，H-19)，1.64(3H，s，H-18)，2.66(1H，t，J=9.6 Hz，H-22)，3.05(2H，dd，J=10.1，5.5 Hz，H-26)，3.41(1H，m，H-3)，3.55(1H，td，J=24.7，5.7 Hz，H-23)，5.38(1H，t，J=2.6 Hz，H-6);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:36.3(C-1)，30.6(C-2)，71.1(C-3)，39.2 (C-4)，143.1(C-5)，121.2(C-6)，28.4(C-7)，41.1(C-8)，48.6(C-9)，31.3(C-10)，30.4(C-11)，125.9 (C-12)，141.7(C-13)，42.0(C-14)，24.1(C-15)，27.4(C-16)，85.9(C-17)，11.8(C-18)，17.6(C-19)，38.3 (C-20)，9.5(C-21)，65.5(C-22)，74.5(C-23)，38.0(C-24)，30.6(C-25)，52.0(C-26)，17.5(C-27)。与文献［9］数据对照，确定化合物2 为环巴胺。

化合物3 室温下，将20 mg 介芬胺溶于2 mL 二氧六环中，缓慢滴加2 mL 甲醇，搅拌至介芬胺完全溶解。加入NaBH440 mg，反应48 h。薄层检测反应终止后，自然冷却至室温。后处理:丙酮淬灭反应，抽滤除去不溶物。减压回收溶剂后，加水、氯仿震摇。氯仿萃取多次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压回收溶剂得白色固体残渣。乙酸乙酯∶石油醚∶三乙胺=1∶2∶0.1 为展开剂，薄层制备板分离，得白色固体13.5 mg。白色无定型粉末，Dragendorff试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 430［M+H］+，分子式为C27H43NO3。核磁数据见表2。

化合物4 称取15 mg 的介芬胺，溶于5 mL THF中，冰浴下加入40 mg LiAlH4，N2保护下反应，薄层检测反应终止后，停止反应。后处理:加饱和NH4Cl溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压回收溶剂得白色固体残渣。二氯甲烷∶石油醚∶三乙胺=9∶1∶0.1 制备板分离，得白色固体5.5 mg。白色无定型粉末，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 446［M +H］+，分子式为C27H43NO4。核磁数据见表2。

1.3 介芬胺的氧化及甲基化

图2 介芬胺的氧化及甲基化反应Fig.2 The oxidation and methylation of Jervine

化合物5 称取40 mg 介芬胺溶于10 mL 甲苯中，加入环己酮0.1 mL 和异丙醇铝40 mg，110 ℃下回流反应4 h，薄层检测反应终止后，反应液冷却至室温。后处理:减压蒸馏蒸除甲苯，加入少许二氯甲烷溶解，制备板分离(展开剂为二氯甲烷∶石油醚∶三乙胺=1∶2∶0.1)，得固体32 mg。白色粉末，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 424［M+H］+，分子式为C27H37NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.75(1H，s，H-5)，3.33(1H，td，J=10.6，3.9 Hz，H-23)，3.10(1H，dd，J=12.5，3.8 Hz，H-26a)，2.73(1H，t，J=9.3 Hz，H-22)，2.15(3H，s，H-18)，1.17(3H，s，H-19)，0.98(3H，d，J=7.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=7.6 Hz，H-27)。

化合物6 称取40 mg 4-烯-3-酮介芬胺(5)溶于5 mL 乙醇中，加入K2CO370 mg，冰浴下，加入CH3I 0.25 mL。TLC 检测反应终止，停止反应。后处理:减压蒸馏蒸除溶剂，加水和氯仿萃取，氯仿层无水硫酸钠干燥，过滤，减压回收溶剂。制备板分离(乙酸乙酯∶石油醚∶三乙胺=1∶1∶0.1)，得固体38 mg 白色固体。Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 438［M +H］+，分子式为C28H39NO3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.75(1H，s，H-5)，3.33(1H，td，J=10.6，3.9 Hz，H-23)，1.05(3H，d，J=7.2 Hz，H-21)，0.97(3H，d，J=7.2 Hz，H-27)，1.16(3H，s，H-19)，2.22(3H，s，H-18)，2.26(3H，s，N-CH3)。

化合物7 制备方法同化合物6。白色固体，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 440［M +H］+，分子式为C28H41NO3，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:5.42(1H，s，H-5)，3.41(1H，m，H-3)，3.52(1H，td，J=10.6，3.9 Hz，H-23)，2.87(1H，J=12.5，3.8 Hz，H-26a)，2.28(3H，s，N-CH3)，2.18(3H，s，H-18)，0.99(3H，d，J=7.2 Hz，H-27)，1.05(3H，d，J=7.2 Hz，H-21)，1.02(3H，s，H-19)。

化合物8 称取40 mg 介芬胺溶于4 mL 二氯甲烷中，称取32.4 mg mCPBA 溶于二氯甲烷中，滴加至反应液中，28 ℃下反应24 h。TLC 检测反应终止后，停止反应。后处理:加饱和NaHCO3溶液5 mL，剧烈搅拌15 min，二氯甲烷萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压回收溶剂。制备板分离(二氯甲烷∶石油醚∶三乙胺=2∶1∶0.5)，得12 mg 白色固体，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 442［M+H］+，分子式为C27H39NO4，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:5.41(1H，s，H-5)，3.48(1H，m，H-23)，3.38(1H，m，H-3)，3.28(1H，dd，J=12.5，3.8 Hz，H-26a)，2.17(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，1.12(3H，d，H-21)，1.02(3H，d，H-27)。

化合物9 制备方法同化合物8。白色粉末，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 454［M +H］+，分子式为C28H39NO4，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:5.76(1H，s，H-5)，4.32(1H，td，J=10.6，3.9Hz，H-23)，3.44(1H，J=12.5，3.8 Hz，H-26a)，2.95(1H，t，J=9.3 Hz，H-22)，3.35(3H，s，NCH3)，2.13(3H，s，H-18)，1.40(3H，d，H-21)，1.16(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，H-27);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:204.3(C-11)，199.4(C-3)，168.1(C-5)，144.9(C-13)，137.4(C-12)，125.7(C-4)，85.2(C-17)，77.5(C-26)，77.2(C-23)，70.7(C-22)，64.3(C-9)，57.2(N-CH3)，43.7(C-14)，41.4(C-8)，39.1(C-24)，38.4(C-1)，37.6(C-10)，35.2(C-2)，33.6(C-6)，32.7(C-20)，30.9(C-16)，29.8(C-7)，25.3(C-15)，23.8(C-25)，17.9(C-27)，16.9(C-19)，12.7(C-18)，12.2(C-21)。

化合物10 制备方法同化合物8。白色粉末，Dragendorff 试剂显橘红色。ESI-MS:m/z 472［M +H］+，分子式为C28H41NO5，1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:4.11(1H，td，J=10.6，3.9 Hz，H-23)，3.73(1H，m，H-3)，2.10(3H，s，H-18)，1.34(3H，d，H-21)，1.01(3H，d，H-27)，1.05(3H，s，H-19);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:207.2(C-11)，144.7(C-13)，137.2(C-12)，85.2(C-17)，76.7(C-26)，76.3(C-23)，70.5(C-22)，67.8(C-3)，67.1(C-5)，59.5(C-6)，56.2(N-CH3)，48.3(C-9)，44.5(C-14)，38.6(C-4)，37.9(C-24)，36.8(C-10)，36.0(C-1)，35.4(C-20)，31.6(C-8)，30.4(C-16)，29.9(C-2)，27.1(C-7)，25.0(C-15)，23.6(C-25)，16.3(C-27)，14.6(C-19)，11.6(C-18)，10.8 (C-21)。

1.4 环巴胺及类似物对人胰腺癌Aspc-1 和人胃癌SGC-7901 细胞增殖的影响

以人胰腺癌Aspc-1 和人胃癌SGC-7901 为测试细胞株，以DMEM 培养基进行培养。取对数生长期的细胞，以0.25%胰酶消化1 至3 min，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配成单个细胞悬液，以每孔3000 个细胞接种到96 孔板上，每孔体积100 μL，培养24 h。用DMSO 溶解待测样品，以DMEM 培养液稀释成不同浓度(分别为1、10、30、50、80、100 μmol/L)。分别培养48 h、72 h 后，以MTT 法测定样品的抑制率，计算IC50(μmol/L)，结果如表1 所示。

表1 环巴胺及类似物对Aspc-1 和SGC-7901 癌细胞的体外抑制作用Table 1 The effect of synthesized compounds on Aspc-1 and SGC-7901 cancer cells by MTT assay

2 结果与讨论

2.1 介芬胺的选择性还原

微波反应以其热效率高、加热速度快可以进行一些常规加热方式下不能进行的反应等优点而成为有用的有机合成工具之一。在以黄鸣龙反应还原介芬胺的实验中，常规反应条件下反应时间长且条件苛刻。本实验中尝试微波反应，设置微波功率为600 W，在200 ℃反应4 h，较文献［10］报道的14.5 h明显缩短了反应时间。

此外，氢化铝锂和硼氢化钠是两种常用的金属氢化物还原剂，还原能力很强，且具有较高的选择性。一般情况下，这类还原剂只还原羰基，不还原碳碳双键，但α，β-不饱和酮有可能被还原。本文运用硼氢化钠和氢化铝锂对介芬胺进行还原，其中的11位羰基和12、13 烯键均被还原，而5、6 位的孤立双键不受影响，分别得到了两种还原产物:11-羟基-12，13-二氢环巴胺(化合物3)和11，12-二羟基-12，13-二氢环巴胺(化合物4)。

2.2 还原产物3 和4 的结构表征

化合物3:ESI-MS:m/z 430 ［M +H］+，分子式为C27H43NO3。13C NMR(100 MHz，CD3OD)给出27个碳信号，其中有2 个双键碳信号δ144.1(C-5)和δ120.7(C-6)，无介芬胺的12 位羰基信号和C-12、C-13 双键信号，提示α，β-不饱和酮的双键和羰基均被还原。δ86.8、75.1、76.2、71.1 为4 个连氧碳的信号，δ9.4、11.4、17.8 和20.4 为四个甲基碳信号。结合HSQC、COSY、HMBC 谱(见图3)，推测化合物3 的结构为11-羟基-12，13-二氢环巴胺，核磁数据见表2。在NOESY 谱(见图3)中，H-22 与18-CH3有NOE 效应，推测18-CH3为β 构型，即H-13 为α-H。由H-11 与19-CH3有NOE 效应，推测H-11 为β-H。而H-11 与H-12 有NOE 效应，则H-12 为β-H。因此化合物3 的立体构型确定为11-βH、12-βH、13-αH。

图3 化合物3 的HMBC 和NOESYFig.3 Key HMBC and NOESY correlations of compound 3

化合物4:ESI-MS:m/z 456 ［M +H］+，分子式为C27H43NO4。13C NMR 中存在2 个双键碳信号δ143.7(C-5)和δ121.7(C-6)，无介芬胺的11 位羰基信号和C-12、C-13 双键碳信号，提示11 位羰基和12、13 位双键均被还原。与介芬胺相比，增加了一个含氧碳信号δ85.46 (C-12)。结合1H NMR、HSQC、COSY，推测化合物4 的结构为11，12-二羟基-12，13-二氢环巴胺，核磁数据见表2。

表2 化合物3 和4 的13C 和1H 核磁数据(in CD3OD)Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compound 3 and 4 (in CD3OD)

2.3 环巴胺及类似物对人胰腺癌Aspc-1 和人胃癌SGC-7901 细胞增殖的影响

实验结果可以发现，介芬胺的三种还原产物中只有环巴胺显示了良好的抑制活性，而其它两个还原产物的抑制活性与介芬胺类似，说明11 位的取代基与化合物的抗肿瘤活性密切相关，当11 位为亚甲基时抗肿瘤活性较强，羟基和羰基均降低活性。此外，在氧化产物和甲基化产物中，只有化合物5 对Aspc-1 和SGC-7901 两种细胞均具有较好的抑制活性，其IC50(72 h)分别达到66.68 和66.31 μmol/L，表明3 位羟基的氧化可能会增强化合物的抗肿瘤活性。

1 Altaba AR，Sánchez P，Dahmane N.Gli and hedgehog in cancer:tumors，embryos and stem cells.Nature Reviews Cancer，2002，2:361-372.

2 Zhang X，Harrington N，Moraes RC，et al.Cyclopamine inhibition of human breast cancer cell growth independent of Smoothened (Smo).Breast Cancer Res Treat，2009，115:505-521.

3 Sasai K，Romer JT，Lee Y，et al.Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells:implications for preclinical studies.Cancer Res，2006，66:4215-4222.

4 Chen JK，Taipale J，Cooper MK，et al.Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.Genes Dev，2002，16:2743-2748.

5 Tremblay MR，Lescarbeau A，Grogan MJ，et al.Discovery of a potent and orally active hedgehog pathway antagonist (IPI-926).J Med Chem，2009，52:4400-4418.

6 Rudin AJ，Miller WH，Eigl BJ，et al.A phase I study of IPI-926，a novel hedgehog pathway inhibitor，in patients (pts)with advanced or metastatic solid tumors.J ClinOncol，2011，29:3014.

7 Wintersteiner O，Moore M.Jervine.XIV.Isojervin-11β-ol and related reduction products of isojervine.J Organ Chem，1965，30:528-533.

8 Masamune T，Sato N，Kobayashi I，et al.Syntheses and NMR spectra of22，27-imino-17，23-oxidojervane derivatives.Tetrahedron，1967，23:1591-1612.

9 Giannis A，Heretsch P，Sarli V，et al.Synthesis of cyclopamine using a biomimetic anddiastereoselective approach.AngewChemInt Ed，2009，48:7911-7914.

10 Murai A，Arita K，MasamuneT.Stereochemistry of the C and D rings of C-Nor-D-homosteroids.I.The Birch reduction of Jervine-11β-ol and related compounds.Bull ChemSoc Japan，1973，46:3536-3544.