半边莲总黄酮提取工艺及抑菌活性的研究

蒋琼凤，温拥军，袁志辉

1湖南科技学院，永州 425199;2 湖南化工职业技术学院，株州 412004

半边莲(Lobelia chinensis lour)为桔梗科半边莲的干燥全草，为中国药典收录的常用中药，含生物碱、黄酮甙、皂甙、氨基酸［1，2］等多种活性成分，既可内服又可外用，疗效较好，具有显著的抗肿瘤、抗氧化、镇痛消炎等药理作用［3-5］，是一类值得大力开发应用的植物。目前有关半边莲的药效研究主要集中在半边莲生物碱上，对黄酮的研究鲜有报道。黄酮类化合物具有清除自由基、抗衰老、抗癌、抗病毒、抗菌消炎等［6，7］多种生物活性，由于合成食品添加剂的毒副作用，从植物当中提取黄酮作为天然抑菌剂或防腐剂越来越受到人们的青睐［8］。本研究对半边莲中总黄酮进行提取，并优化其工艺条件，同时考察半边莲黄酮提取物对常见细菌、真菌的抑制作用，旨在为开发半边莲天然食品保鲜剂提供理论依据，也为拓宽医疗病种提供一定参考思路，使半边莲更广泛地应用于临床。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

半边莲(湖南永州中草药材市场采购)，洗净后干燥至水分含量在0.5%以下，粉碎过40 目筛备用。芦丁标准品(中国药品生物制品检验所);硝酸铝、亚硝酸钠、95%乙醇、氢氧化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖等均为分析纯。供试菌株:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、青霉菌、酵母菌等均由湖南科技学院微生物实验室提供。

752 型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，AY220 型电子分析天平(岛津国际贸易公司)，WD800GL 型微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)，旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，自动型手提式灭菌锅YXQ-LS-18SI(上海博迅实业有限公司)，恒温光照培养箱MJX-250B-Z(上海博迅实业有限公司)，超净工作台ZHJH-1109(上海制成分析仪器制造有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 半边莲总黄酮的提取

精密称取半边莲粉末0.500 g 于烧杯中，加入一定量一定浓度的乙醇，在一定水浴温度下提取一定时间，提取液经旋转蒸发仪干燥、浓缩至膏状，得总黄酮粗提物。单因素实验分别考察不同乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间对半边莲总黄酮得率的影响，在单因素实验基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间中影响较大的三个水平进行L9(34)正交实验设计，见表1。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品0.020 g，用70%乙醇溶解于100 mL 的容量瓶中，定容配制成0.20 mg/mL芦丁标准溶液。精确吸取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加入0.5mL 5%的亚硝酸钠和0.5 mL、10%的硝酸铝分别静置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 的氢氧化钠溶液并用70%乙醇定容，静置15 min，以70%乙醇液作空白溶液，用752 型分光光度计在510 nm 处测定吸光度值［9］。然后以芦丁浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度值A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=10.3x-0.002，R2=0.9989。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 样品液总黄酮的测定

精密吸取样品液于25 mL 的容量瓶中，按标准曲线法在510 nm 处测定吸光度，并以下式计算总黄酮提取率(%):

式中:C-为总黄酮质量浓度(mg/mL);V-半边莲总黄酮提取液的体积(mL);N-为稀释的倍数;M-为半边莲样品质量(g)。

1.2.4 半边莲黄酮的抑菌作用

1.2.4.1 总黄酮提取物的制备

称取半边莲粉末，以料液比1∶50，加入70%乙醇，在60 ℃下提取2.5 h，经旋转蒸发仪干燥、浓缩至膏状，得总黄酮粗提物，密封，于0～4 ℃保存。使用前准确称取膏状物样品用0.85%生理盐水配制成1 g/mL 和0.1 g/mL 样品溶液，置于紫外灯下照射1 h 灭菌后备用。

1.2.4.2 菌悬液的制备

细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用察氏培养基。将供试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、酵母菌分别移接入相对应的培养基上培养，细菌37 ℃培养24 h，真菌30 ℃培养48 h。取活化好的菌种斜面，分别溶于50 mL 无菌生理盐水中，充分振荡摇匀，平板计数法制成含菌数1.0 ×106cfu/mL 的菌悬液，并稀释至1.0 ×103cfu/mL，留存备用。

1.2.4.3 抑菌活性的测定

将直径90 mm 培养皿上的培养基分为3 个区，用移液器吸取0.1 mL 的菌悬液，涂布均匀后，每个区分别用8 mm 的打孔器打孔，其中2 孔为平行，1孔无菌生理盐水为对照，每孔加入0.2 mL 的半边莲黄酮提取液。细菌置于37 ℃恒温培养箱内培养1 d后，测定抑菌圈直径大小;青霉菌及酵母菌于30 ℃培养3～5 d 后测定抑菌圈直径。

1.2.4.4 半边莲总黄酮的最低抑菌浓度(MIC)测定

取0.1 g/mL 的半边莲总黄酮样品液，采用二倍稀释法［10］稀释为:100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0 mg/mL 并加入到培养基中，将浓度为1.0×103cfu/mL 菌悬液接种到各试管内，细菌置于37℃恒温培养箱内培养1 d 后，霉菌及酵母菌于30 ℃培养3～5 d，观察结果。以完全无菌生长的最高稀释度为半边莲总黄酮对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

在提取时间2 h、料液比1∶40、水浴温度60 ℃条件下，分别用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇进行提取，考察乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，结果见图1(A)。

由图1(A)可知，随着乙醇浓度的增大，总黄酮的提取率也增加，当乙醇浓度为70%时总黄酮提取率最大;乙醇浓度继续增大，总黄酮提取率反而减少。可能是由于乙醇浓度不同，相对杂质含量不同，其极性也不一样，在乙醇浓度为70%时，极性相似，使黄酮提取率最高。

2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响

分别以1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 的料液比，在提取时间2 h、乙醇浓度70%、水浴温度60 ℃下进行提取，考察料液比对总黄酮提取率的影响，结果见图1(B)。

由图1(B)可知，随着溶剂量的增加，总黄酮提取率逐渐升高，到50 倍量以后基本持平。由于料液比增加，会给后续处理工序增加困难，在保证提取效果的前提下，为节约成本，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷，故选用1∶40、1∶50、1∶60 进行正交实验。

2.1.3 提取温度对总黄酮提取率的影响

在料液比1∶40、乙醇浓度70%，提取时间2 h条件下，分别以水浴温度40、50、60、70、80 ℃下进行提取，考察水浴温度对总黄酮提取率的影响，结果见图1(C)。

由图1(C)可知，当温度低于60 ℃时，总黄酮提取率随着温度的升高而增加，可能温度的升高，溶剂的粘度减小，分子运动速度加快，浸提液的扩散系数增加，促使浸提速度加快，提取率升高;温度高于60℃时，黄酮提取率反而降低，可能温度的升高使黄酮化合物结构遭到破坏，故提取率降低。

2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

在水浴温度60 ℃、料液比1∶40、乙醇浓度70%条件下进行提取，分别提取1、1.5、2、2.5、3 h，考察提取时间对总黄酮提取率的影响，结果见图1(D)。

由图1(D)可知，随着提取时间的延长，总黄酮提取率先升高后下降。可能提取时间越长，总黄酮在乙醇溶液中充分溶解，提取率最高;但提取时间过长，会导致部分总黄酮的氧化分解，从而提取率降低。

图1 乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid-liquid ratio (B)，extraction temperature (C)and extraction duration (D)on the extraction yield of total flavonoids

2.2 正交实验优化提取工艺

按1.2.1 中表1 进行实验，结果见表2。

由正交试验的极差分析可知，乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对半边莲中总黄酮的提取率均有不同程度的影响，其中提取时间影响最大，料液比影响最小，各因素的影响顺序依次是:B ＞A ＞D ＞C，即提取时间＞提取温度＞乙醇浓度＞料液比。

综上所述分析可得半边莲中总黄酮的提取工艺最佳组合是:A2B2C1D2，即提取温度60 ℃、提取时间2.5 h、料液比为1∶40、乙醇浓度为60%。采用上述最优工艺条件进行验证试验，最终得到半边莲中总黄酮提取率为1.69%。

2.3 半边莲总黄酮提取物的抑菌效果

2.3.1 抑菌活性

由表3 可知，半边莲提取物溶液对6 种供试菌均有一定的抑制作用，提取液浓度在1.0 g/mL 时对各菌的抑菌作用明显大于0.1 g/mL;提取物对各供试菌的抑制效果不同，其强弱顺序为:大肠杆菌＞变形杆菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞青霉菌＞酵母菌。黄酮类化合物属于酚类衍生物，可以通过破坏细胞壁以及细胞膜结构的完整性，导致微生物细胞释放胞内成分，引起膜的电子传递、ATP 活性等功能障碍［8］，从而抑制微生物的生长。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 半边莲总黄酮提取物对各供试菌的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of total flavonoids from L.chinensis on the tested microbateria

2.3.2 半边莲总黄酮的最低抑菌浓度

由表4 可知，半边莲黄酮提取物对各供试菌的抑制作用随着浓度的增大而增加;样品溶液为100 mg/mL 和50 mg/mL 时各供试菌株均不能生长，在25 mg/mL 时枯草芽孢杆菌少量生长，在12.5 mg/mL 时金黄色葡萄球菌少量生长，在6.25 mg/mL 时大肠杆菌与变形杆菌均可生长，故半边莲总黄酮提取物对大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为:12.5、12.5、25、50 mg/mL;提取物浓度为100 mg/mL 时，对青霉菌和酵母菌抑制作用均不明显。

3 结论与讨论

本研究以总黄酮提取量为技术指标，采用热水辅助乙醇提取法，通过单因素和正交实验，得到了半边莲中总黄酮的最佳提取工艺条件为:以60%乙醇作为溶剂，料液比为1∶40(g/mL)，水浴温度60 ℃，水浴处理时间是2.5 h。此条件下，总黄酮提取率为:1.69%。半边莲总黄酮提取物具有一定的抑菌活性，对大肠杆菌的抑制效果最好，其次为变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌和酵母菌。在半边莲提取物溶液浓度为100 mg/mL 或低于100 mg/mL 时，对青霉菌和酵母菌抑制作用不明显。

表4 半边莲总黄酮提取物对各供试菌的最低抑菌浓度Table 4 The MIC of total flavonoids from L.chinensis on the tested microbateria

研究中半边莲总黄酮提取物对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑制效果大于其他两种革兰氏阳性菌，此结果与徐金龙等［11］人研究南酸枣黄酮提取物的抑菌活性结果有出入，可能是黄酮类化合物在半边莲中存在的形式与其不同，详尽原因还有待进一步研究。半边莲属植物品种繁多，分布广泛，我国共有20 多种，资源相当丰富，且半边莲提取物对细菌、霉菌均有抑制作用，说明半边莲黄酮是值得大力推广的天然抑菌剂和保鲜剂。

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