烟草WRKY—R1基因的克隆及瞬时表达分析

胡曼+宋丹丹+杨金淼+刘卫群

摘要：以烟草根尖组织cDNA为模板，RT-PCR结合电子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF，序列分析显示，NtWRKY-R1具有WRKY转录因子家族典型的WRKYGQK保守结构域及C2H2的锌指结构，属于WRKY转录因子家族第Ⅱ类。采用生物信息学方法对NtWRKY-R1蛋白的理化性质、进化关系和磷酸化位点进行预测和分析，结果表明，NtWRKY-R1与茄科植物保守结构域的同源性及系统进化关系最近；磷酸化位点分析显示该蛋白可能通过磷酸化作用修饰，进而对其相应的代谢活动进行调节。通过构建真核表达载体、建立瞬时表达分析体系，结果显示，NtWRKY-R1基因的过表达导致JA信号途径标记基因PDF1.2及烟碱合成关键酶基因PMT1表达量降低，推测NtWRKY-R1基因影响JA信号途径，进而调控烟碱合成。

关键词：烟草； NtWRKY-R1；基因克隆；生物信息学分析；瞬时表达分析；信号途径

中图分类号：S572.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0012-06

WRKY是植物中最大的转录因子家族之一，因含有7个氨基酸组成的高度保守的WRKYGQK序列而得名。研究发现WRKY类转录因子广泛参与植物生物[1～3]、非生物[4，5]胁迫应答，植物衰老[1]和器官发育[6]等一系列生理活动。目前，有关WRKY转录因子的研究已取得很大进展，但主要集中在基因克隆、表达及通过功能缺陷或超表达研究其功能，对其介导的植物应答反应过程、逆境胁迫下的反应调控机制等仍然不清楚。

烟株打顶是一项重要的农艺措施，打顶后，烟草叶中的烟碱合成量增加。有研究表明，打顶可诱发烟碱生物合成增加是烟株响应伤害信号和激素水平改变等综合效应的结果。机械伤害诱导第二信使茉莉酸（JA）产生，JA信号途径诱导烟碱合成关键酶腐胺N-甲基转移酶（PMT）和鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因转录水平升高，促进烟碱的生物合成[12]。本课题组从烟草打顶前、后根尖组织消减抑制杂交（SSH）cDNA文库中筛选出一条wrky-like的EST（HO059652）序列[7]，采用电子克隆结合RT-PCR的方法克隆到该基因，并对其进行了生物信息学及瞬时表达分析，为探讨烟株打顶后烟碱合成能力增加的调控机制及该转录因子在地上部伤害刺激诱导根系次生代谢产物积累的分子机制奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1植物材料供试烟草品种K326（Nicotiana tabacum L.cv. K326）。

1.1.2菌株、载体与主要试剂大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和植物表达载体pROK2由本实验室保存；TRIzol、MLV、pMDTM19-T Vector、纤维素酶等购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取及反转录选取生长5～6周的实验室栽培烟草K326植株，TRIzol法提取烟草根尖组织总RNA，反转录为cDNA，提取和反转录方法均参照试剂说明书。

1.2.2NtWRKY-R1基因的电子克隆以本实验室构建的烟草打顶前、后的SSH cDNA文库中筛选出的一条WRKY类转录因子EST序列（HO059652）为查询探针，在烟草的EST数据库中进行查询搜索，最后拼接得到一条含有完整ORF的cDNA序列。以此序列设计特异引物，以烟草根尖组织cDNA为模板，进行PCR扩增。引物序列F：5′-GCTAGGATCCCATGGATGGAAGATTCAAT-3′（划线处为BamHⅠ酶切位点）；R： 5′-TAGGTACCTCAGCCCGTGGTCCCACAC-3′（划线处为KpnⅠ酶切位点）。扩增产物连接至pMDTM 19-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，鉴定并测序。

1.2.3NtWRKY-R1的生物信息学分析从NCBI数据库中BLAST得到拟南芥（AAS79556）、辣椒（AAZ99027）、马铃薯（ABU49724）、大豆（ABS18444）、蓖麻（XP_002522247）、棉花（ACD56629）、小麦（ABO15543）、水稻（DAA05131）的WRKY氨基酸序列。

依据MEGA 4.1软件对所获得氨基酸序列的保守结构域与NtWRKY-R1的保守结构域进行同源性比对和聚类分析；NtWRKY-R1蛋白的理化性质、磷酸化修饰和亲水性/疏水性分析分别用ProtParam、NetPhos 2.0 Server和ProtScale分析，蛋白二级结构的预测用Scansite、SOPMA在线工具完成。

1.2.4NtWRKY-R1瞬时表达载体的构建用BamHⅠ和KpnⅠ同时双酶切质粒pROK2和pMDTM19-T-NtWRKY-R1，回收目的片段；用T4 DNA连接酶16℃、过夜连接，然后转化大肠杆菌DH5α，构建融合质粒pROK2-NtWRKY-R1。热激法将此融合质粒和空载体分别转化农杆菌GV3101感受态，Kan抗性筛选和菌液PCR验证阳性克隆子。

1.2.5瞬时表达分析参照Sheen lab给出的原生质体制备和PEG介导原生质体转化[13]的方法制备并转化烟草原生质体，作为对照的原生质体、原生质体与两种质粒的混合液分别置于光照培养箱中，孵育6～18 h，用布氏漏斗和真空泵尽可能多地除去细胞中培养基，TRIzol法提取RNA，Primer 5.0设计特异性引物，半定量RT-PCR检测PDF1.2、PMT1和NtWRKY-R1基因的瞬时表达水平。PDF1.2引物为PDF1.2-F：5′-GCGCCACACAACACATACATCTATACATTG-3′，PDF1.2-R：5′-GCGCCGGTATTTTTATATTATTGTAACAACAA-3′；PMT1引物为PMT1-F：5′-GCCCTGAACACCTCAACGGCTAC-3′，PMT1-R：5′-GCGTTCGATTGAAGGATAACGAAGCATT-3′；以Actin基因为内参，引物为Actin-F：5′-ATGGCGGATGGGGAGGACAT-3′，Actin-R：5′-TTAGAAGCATTTGCGGTG-3′。endprint

2结果与分析

2.1NtWRKY-R1基因的克隆及序列分析

表明，NtWRKY-R1基因ORF全长915 bp，编码304个氨基酸，编码蛋白具有WRKY转录因子家族典型的保守结构域和高度保守的7个氨基酸残基WRKYGQK（图2）。

2.2NtWRKY-R1蛋白的生物信息学分析

2.2.1不同WRKY蛋白的同源性比对及进化分析通过同源性比对（图3）发现不同物种来源的WRKY之间有高度的同源性，并且NtWRKY-R1与茄科植物保守结构域的同源性均达到85%。系统进化分析（图4）显示，NtWRKY-R1蛋白与茄科植物聚类在一起，而与其它非茄科植物距离较远。

2.2.2NtWRKY-R1蛋白的理化性质分析NtWRKY-R1蛋白含有304个氨基酸，分子量为34.21 kD，等电点为5.69，在酸性范围内，属亲水蛋白。

2.2.3NtWRKY-R1蛋白二级结构预测用SOPMA预测NtWRKY-R1蛋白的二级结构（图5），结果显示，α-螺旋占21.71%；β-折叠为9.87%；β-转角最少，仅为3.62%；其余为无规则卷曲。这些二级结构构成NtWRKY-R1的基本结构。

2.2.4NtWRKY-R1蛋白磷酸化位点分析利用NetPhos 2.0 Server 在线分析NtWRKY-R1蛋白的磷酸化位点，结果（图6）表明，该蛋白共有22个磷酸化位点，其中18个丝氨酸位点，4个苏氨酸位点。

2.3NtWRKY-R1瞬时表达载体构建及农杆菌转化

BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定融合载体pROK2-NtWRKY-R1，获得大小约915 bp条带（图7），证实重组子含有目的基因，经测序验证结果正确。菌液PCR验证转化农杆菌GV3101菌落（图8），PCR产物大小约915 bp，证明转化成功。

2.4烟草原生质体制备及NtWRKY-R1基因瞬时表达分析

在光学显微镜下观察制备好的原生质体（图9），烟草叶片酶解去除细胞壁后呈圆球形，细胞膜周围分布有绿色的叶绿体，中间透明的为中央大液泡，少许杂质为降解的细胞壁及胞间组织。

PDF1.2、PMT1、NtWRKY-R1基因瞬时表达情况见图10。PDF1.2是响应JA信号的关键基因，PMT1是烟碱合成关键酶PMT基因家族的代表，NtWRKY-R1的表达量增加而PDF1.2的表达量下降，说明NtWRKY-R1能够影响烟草JA信号途径的响应。同时PMT1的表达量下降，表明NtWRKY-R1能够负调控PMT1基因的表达，抑制烟碱的生物合成。

1：对照，即未经转化的原生质体；2：转化空载体pROK2的原生质体；3：转化pROK2-NtWRKY-R1过表达载体的原生质体

3结论与讨论

通过电子克隆结合RT-PCR方法克隆烟草根尖组织获得NtWRKY-R1基因，序列分析显示其N端具有典型WRKYGQK保守结构域，C端有锌指类似结构，表明从烟草根尖组织中克隆得到了典型的WRKY转录因子基因。应用生物信息学的方法分析，NtWRKY-R1在进化关系上与茄科植物最近。有研究发现WRKY蛋白可能处于MAP激酶（MAPK）的下游，其功能受MAPK的修饰。Shen等[9]发现，水稻OsWRKY30与OsMPK3在体外、体内都可以直接互作，且OsWRKY30可被OsMPK3、OsMPK7和OsMPK14体外磷酸化，说明OsWRKY30是水稻MPKs途径中重要的底物。Erik等[8]发现拟南芥MAPK4可激活AtWRKY25和AtWRKY33，且MAPK4能在体外磷酸化这两个蛋白。此外，也有研究证明烟草MAPK或参与调节WRKY的活性[10，11]。NtWRKY-R1转录因子磷酸化位点的分析显示，其多肽序列中有22个磷酸化位点，说明该蛋白响应地上部伤害刺激的过程可能是一个磷酸化的过程，进而对其相应的代谢活动进行调节。

前人研究表明，烟碱合成主要受关键酶ODC、PMT、QPT、MPO、A622调控，而JA可以调控PMT基因（NsPMT）和MPO基因的启动子区，进而控制其表达，因此，JA是烟碱生物合成过程中关键的激素调控因子[14]，且该信号途径激活之后会诱导防御基因PR4、Thi2.1和PDF1.2的表达等[15]。瞬时表达NtWRKY-R1的试验结果显示，NtWRKY-R1的过表达导致JA信号途径关键防御基因PDF1.2和烟碱合成关键酶基因PMT1的表达下调。结合前人的研究，推测NtWRKY-R1抑制了JA信号途径，而JA又通过调控PMT的启动子区域进而影响PMT基因的表达。说明，JA与NtWRKY-R1的表达呈负相关，而与PMT的表达有正相关关系。这为我们进一步研究NtWRKY-R1参与烟碱合成的分子机制奠定了基础。

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