海洛因对人T淋巴细胞线粒体产能代谢的影响

付青梅 张永创 张永春 卜英博 谢淼 王茜

（1.武警贵州省总队医院；2.武警贵州省总队医院药剂科；3.武警贵州省总队医院外二科；4.武警

贵州省总队医院设备科；5.武警贵州省总队医院检验科；6.武警贵州省总队医院内二科，贵州 贵阳550005）

海洛因吸食在世界范围内已成为一种严重的社会公共卫生问题，海洛因、吗啡等阿片类毒品长期滥用可引起细胞变性、坏死，其对人体细胞免疫功能的损伤已被证实［1］。目前针对海洛因吸食的研究众多，但对海洛因吸食者T淋巴细胞线粒体产能代谢功能的报道甚少，且大部分为体外细胞培养的研究。故本实验从不同海洛因吸食年限患者体内抽取外周血，提取T淋巴细胞，对其进行相关指标的检测，旨在从线粒体层面探讨海洛因对人T淋巴细胞线粒体产能代谢的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象为武警贵州省总队医院戒毒中心选择的100例青、中年男性海洛因吸食者，抽取其外周血备用；无钙、镁离子的平衡盐溶液（DHank’s液，pH7.2～7.4）；淋巴细胞分离液（天津市TBD生物技术发展中心产品）；RPMI 1640培养基（GIBCO产品）；小牛血清（华西医科大学生产）；尼龙棉（上海化纤九厂）；MTT（Sigma公司）。

1.2 实验方法 实验方法如下。

1.2.1 实验分组 从我院戒毒中心随机选择100例男性青中年海洛因吸食者，据入院前的综合体检，排除其他疾病；根据海洛因吸食时间，将受试对象分为2年、5年、8年3个组别，实验前告知所有受试对象该研究的目的和意义，并选择20例健康成年男性的外周血作为对照。3组患者的选择标准为20～25岁（年龄标准差在±6.21以内）的吸毒者，且排除其他系统性疾病，无慢性病史。

1.2.2 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离 采用密度梯度离心法，取新鲜上述组别外周血，用DHank’s液稀释2～3倍，充分混匀后用无菌毛细吸管吸取5～6mL稀释的细胞悬液沿管壁小心缓慢地加入预先已装有3mL淋巴细胞分离液的10mL离心管内，水平式转头2 000 r／min离心20min，绝大多数PBMCs悬浮于血浆与分层液界面上，将此层移入另一试管。用5倍以上体积的D－Hank’s液充分 洗 涤，1 600 r／min 离 心 8min，弃 上 清；1 000 r／min离心10min，弃上清液，以去除混杂的血小板，所得PBMCs重悬于含100mL／L胎牛血清蛋白（FCS）的RPMI 1640培养基中备用。

1.2.3 PBMCs中淋巴细胞和单核巨噬细胞的分离采用玻璃器黏附法，将分离的PBMCs细胞数调至2×106个／mL，置于120mm玻璃培养瓶内，充分摇晃混匀，于50mL／L CO2孵箱中37℃静置60～90min后，以毛细吸管小心轻吸未黏附之细胞悬液，即为去除单核细胞的淋巴细胞悬液。

1.2.4 T淋巴细胞的分离纯化 采用尼龙棉柱滤过法，尼龙棉以0.2mol／L HCl浸泡6h，再用大量蒸馏水反复冲洗，晾干。称取尼龙棉50mg将其装填入10mL注射器内，高压灭菌。尼龙棉柱高度为6cm，可有效地过滤（2～3）×107个细胞。用DHank’s液和含200mL／L FCS的RPMI 1640培养基洗柱各2次，以平衡pH、温度、排除空气，37℃放置1h。上柱前先将平衡液放出，加入细胞数为2×107个／mL的淋巴细胞悬液0.5mL，平放尼龙棉柱，以细长的毛细滴管伸入柱内界面加入培养液0.5mL封口，将柱于37℃静置孵育1h。用预温的培养液淋洗柱2～3次，流速控制在1mL／min，收集最初的10mL流出液，1 300 r／min离心10min，计数并调整细胞数，此即分离纯化T淋巴细胞。

1.2.5 T淋巴细胞的培养 将分离的T淋巴细胞培养于含200mL／L FCS、2mmol／L 谷氨酰胺、20mmol／L N－2－羟 乙 基 哌 嗪－N’－2－乙 烷 磺 酸（HEPES）、100U／mL青霉素、100U／mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，调整细胞数为1×106个／mL。

1.2.6 MTT法检测细胞生长情况 将分离所得的T淋巴细胞按2×105个／mL接种于24孔细胞培养板中；加入上述培养基1.5mL培养4h后，部分转入96孔板内（104个／孔），48h后小心吸取孔内培养基，每孔加入80μL无血清培养基和20μL MTT溶液（5μg／L），继续培养4h。小心吸取孔内液体，每孔加150μL二甲基亚砜，低速震荡10min后，用酶标仪检测490nm处的吸光度值。吸光度值反映细胞增殖活性，其高低与细胞增殖活性成正比。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞经培养后，用不含EDTA的胰酶消化后离心收集细胞，每样本细胞数约为2.5×106个，弃培养基，使用PBS洗涤细胞2次，分别依次加入500μL Binding Buffer、5μL Annexin V－FITC、5μL Propidium Iodide混匀，室温避光反应15min后，使用流式细胞仪进行检测。

1.2.8 细胞内ATP含量检测 细胞处理后，消化离心收集细胞，加无血清培养基520μL混匀，加2%三氯醋酸520μL，冰浴5min，离心5min后取300μL上清与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）液300μL和磷酸甘油醛脱氢酶－磷酸甘油激酶10μL混合，经分光光度计检测NADH下降的吸光度，据标准曲线查ATP值。

1.2.9 活性氧（ROS）的 DCFH－DA荧光探针检测细胞分组处理后收集细胞，加入终浓度为10μmol／L的 DCFH－DA，于37℃ 培养箱中孵育30min。孵育结束后，用无血清培养基洗细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH－DA，再次收集细胞后，PBS重悬，用荧光分光光度汁测定2＇，7＇－二氯荧光黄（DCF）的荧光强度。检测条件：激发波长488nm，发射波长525nm，激发和发射波长的光栅宽度均设为5nm。ROS含量与荧光强度呈正相关。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS 19.0统计学软件分析，计量资料以（¯x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同海洛因吸食年限者T淋巴细胞增殖活性对照组测得平均荧光强度值为（0.74±0.06），海洛因吸食2年者测得值为（0.57±0.04），吸食5年者测得值为（0.35±0.05），吸食8年者测得值为（0.27±0.02）。与对照组比较，随着海洛因吸食年限的增加，T淋巴细胞增殖活性逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 不同海洛因吸食年限者T淋巴细胞凋亡情况海洛因吸食对T淋巴细胞凋亡影响后Annexin V－FITC／PI双染结果是对照组测得其细胞凋亡率为（6.20±1.14）%，海洛因吸食2年者测得值为（10.28±1.51）%，吸食5年者测得值为（22.17±2.13）%，吸食8年者测得值为（29.78±2.89）%。与对照组比较，随着海洛因吸食年限的增加，T淋巴细胞凋亡程度逐渐增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 不同海洛因吸食年限对T淋巴细胞内ATP产生的影响 对照组测得其T淋巴细胞线粒体的ATP含量为（0.136±0.021）mmol，海洛因吸食2年者测得其含量为（0.113±0.009）mmol，吸食5年者测得其含量为（0.083±0.008）mmol，吸食8年者测得其含量为（0.062±0.003）mmol。与对照组比较，随着海洛因吸食年限的增加，T淋巴细胞内ATP产生逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 DCFH－DA荧光探针检测细胞内ROS的含量与各自对照组比较，随着亚硒酸钠剂量的增加，细胞DCF荧光强度逐渐减低。相同剂量亚硒酸钠干预的不同组间比较，随着海洛因吸食时间的增加，细胞DCF荧光强度呈现增高趋势。说明亚硒酸钠可使细胞ROS含量降低；而吸食海洛因可使细胞内

ROS含量升高。见表1。

表1 亚硒酸钠对各组细胞内ROS的影响

3 讨 论

有研究［2］发现海洛因吸食成瘾可导致人体免疫功能受损，且海洛因成瘾为造成细胞死亡的主要形式。早期报告亦指出，药物滥用能抑制外周血T细胞的E－花环形成，毒品依赖者外周血T细胞减少，丝裂原诱导的T细胞增殖能力下降，同时，药物滥用不仅对细胞增殖方面产生影响，其能使吸食者体内细胞超微结构发生明显改变［3］。线粒体呼吸链复合物Ⅰ又称CoQ还原酶，复合物Ⅰ缺陷或者抑制导致线粒体内膜质子电化学梯度异常，ATP合成障碍以及增加氧自由基损伤，从而导致细胞凋亡。在前人的研究中有证明海洛因导致了生物状态及抗氧化酶活性的变化，活性氧（ROS）和一些疾病有关，细胞在生理或者病理状态下会产生ROS，当氧化和抗氧化的临界平衡由于抗氧化剂耗尽和（或）过量的ROS堆积被打破时，氧化应激产生。ROS可以和一些大分子发生反应，如脂质，蛋白质，核酸，碳水化合物，特别是膜上的多不饱和脂肪酸。当ROS反应开始后，持续的链式反应会造成细胞损伤，最终细胞死亡［4］。有研究［5］表明，正常人与海洛因吸食患者外周血白细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性，结果显示两组之间线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性有显著差异，海洛因吸食者细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性明显低于正常对照组，因此，本研究从海洛因不同吸食年限的人群中，抽取外周血，提取T淋巴细胞，通过检测细胞内ATP含量发现，随着海洛因吸食年限的增加，T淋巴细胞内ATP产生逐渐减少，这可能与海洛因吸食者线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性低于正常对照组有关，亦因线粒体呼吸链复合物Ⅰ缺陷从而导致线粒体内膜质子电化学梯度异常，ATP合成障碍从而导致细胞凋亡；通过检测各组细胞的凋亡发现，随着海洛因吸食年限的增加，人体外周血中T淋巴的凋亡逐渐增加，细胞的增殖活性逐渐降低，这可能是海洛因在人体T淋巴细胞线粒体水平影响下对细胞生长作用中的宏观体现。

由此可见，长时间吸食海洛因可造成机体氧化应激状态超负荷，通过增加自由基的产生，ROS与大分子反应以及之后的持续链式反应，使线粒体正常结构和功能发生改变，影响其产能效应，最终导致细胞凋亡增加和（或）细胞增殖减少，从而通过线粒体途径对T淋巴细胞产生不利影响。

［1］ Zhuang W X，Tatia L，John X Z，et al.Thirsty heroin addicts show different fMRI activations when exposed to water－related and drug－related cues［J］.Drug Alcohol Depend，2006，83：157－162.

［2］ 韦献良，叶峻.海洛因成瘾大白鼠脑神组织超微机构变化的研究［J］.电子显微学报，2004，23（1）：31－32.

［3］ Yang SH，Chien CM，Lu MC，et al.Cardiotoxin Ⅲinduces apoptosis in K562cells through a mitochondrial－mediated pathway［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2005，32（7）：515－520.

［4］ Mustafa Cemek，Mehmet Emin Büyükokuroglu，Omer Hazman，et al.Sait Bulut＆ Yavuz Osman Birdane The Roles of Melatonin and Vitamin E Plus Selenium in Prevention of Oxidative Stress Induced by Naloxone－Precipitated Withdrawal in Heroin－Addicted Rats［J］.Biol Trace Elem Res，2011，142：55－66.

［5］ 周亮，林敏仕.线粒体呼吸链复合物I缺陷与海洛因海绵体状白质脑病的关系［J］.南方医科大学学报，2013，33（9）：1357－1361.