酸枣仁皂苷回流提取工艺的响应面优化

祝洪艳，张力娜，林海成，王月珍，王国丽，赵 岩，郜玉钢，张连学

(1 吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2 长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

酸枣仁皂苷回流提取工艺的响应面优化

祝洪艳1，张力娜1，林海成1，王月珍2，王国丽1，赵 岩1，郜玉钢1，张连学1

(1 吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2 长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

【目的】 采用中心组合试验-响应面法优选酸枣仁皂苷的最佳回流提取工艺，为酸枣仁皂苷提取的工业化生产提供依据。【方法】 采用HPLC-UV检测酸枣仁皂苷A和B的含量，用乙醇回流提取法，以乙醇体积分数(0，30%，50%，70%，80%，95%)、液固比(8∶1，10∶1，12∶1，15∶1，20∶1)、提取时间(1，1.5，2，2.5，3 h)和提取次数(1，2，3，4)为考察因素，筛选各因素对酸枣仁皂苷提取影响的取值范围，在此基础上进行中心组合试验，用SAS(9.2)软件建立预测模型，响应面分析最佳提取条件。【结果】 响应面分析优选得到的酸枣仁皂苷最佳提取工艺为：体积分数66%乙醇，液固比12.5∶1，回流提取3次，每次1.8 h。在此条件下，酸枣仁皂苷A和B含量之和平均为 1.21 mg/g，与模型预测值(1.30 mg/g)接近。【结论】 用中心组合设计-响应面法优选的酸枣仁皂苷A和B提取工艺可信度高，皂苷含量验证值与模型预测值接近，模型预测效果好，工艺稳定，可用于指导酸枣仁皂苷的工业化提取生产。

酸枣仁皂苷A；酸枣仁皂苷B；提取工艺；中心组合设计-响应面法

酸枣仁(Ziziphi spinosae semen)为我国传统安神中药，具有养心补肝、宁心安神、敛汗生津之功效[1]。酸枣仁皂苷和黄酮类化合物为其主要安神作用药效成分[2-5]，其中酸枣仁皂苷A、B和斯皮诺素分别是皂苷和黄酮类的代表性单体成分。前人对酸枣仁提取工艺的研究不多，主要采取正交试验设计，以比色法检测酸枣仁总皂苷或总黄酮的含量[6-8]，也有以HPLC检测酸枣仁皂苷A的含量[9-11]为指标进行工艺优选。而工艺优选中常用的响应面分析法采用多元二次回归方程分析最优工艺参数，试验次数多，预测性较正交试验设计好。国内学者分别采用响应面法优选了酸枣仁总黄酮[12]和蛋白[13]的提取工艺，叶振梅[14]以皂苷提取物质量为检测指标，应用响应面法分析了酸枣仁皂苷的提取工艺。本试验采用中心组合设计结合响应面法试验优选酸枣仁皂苷的最佳提取工艺，采用HPLC法检测酸枣仁皂苷A和B的含量，以两者之和为指标，优选提取工艺参数，考察提取工艺的可行性，以期为酸枣仁皂苷提取的工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料 酸枣仁购于当地药店，产地河北省，经吉林农业大学中药学院张连学教授鉴定为鼠李科植物酸枣[ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟种子，研磨成粉备用；酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B对照品购于上海源叶生物科技有限公司，批号：20120423，20120522。

1.1.2 仪 器 Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，BS210S万分之一天平(德国SARTORIUS科学仪器有限公司)，RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 HPLC-UV色谱条件 Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈-水(体积比34∶66)[15]；柱温25 ℃；检测波长204 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取酸枣仁皂苷A 2.4 mg、酸枣仁皂苷B 1.2 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇配成质量浓度分别为0.24 mg/mL和0.12 mg/mL的对照品贮备液。分别精密量取5.0 mL对照品贮备液置同一10 mL量瓶中混合，加甲醇定容，制成质量浓度为0.12和0.06 mg/mL的酸枣仁皂苷A、B的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取酸枣仁粗粉(筛网孔径为0.425 mm)5.0 g，加石油醚连续回流脱脂6 h，挥干石油醚，药渣加梯度乙醇(体积分数为0，30%，50%，70%，80%，95%)回流提取，提取物加50 mL水溶解，再用50 mL水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，回收溶剂即得酸枣仁皂苷提取物。提取物加甲醇溶解，定容至10 mL，0.45 μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。

1.2.4 标准曲线的制备 精密吸取混合对照品溶液2，4，6，10，16，20 μL，按1.2.1中色谱条件进样。以进样量X(μg)为横坐标，酸枣仁皂苷A和B的峰面积(Y)为纵坐标，计算酸枣仁皂苷A和B的回归方程为：YA=324.96XA+18.229，rA=0.999 3；YB=295.68XB+2.509 7，rB=0.999 0。酸枣仁皂苷A和B分别在进样量为0.48～4.80 μg和 0.24～2.40 μg时与其对应的峰面积有良好的线性关系。

1.2.5 样品含量的测定 分别精密吸取酸枣仁皂苷A、B对照品溶液和供试品溶液20 μL，按1.2.1中色谱条件进样，分别计算供试品溶液中酸枣仁皂苷A和B的含量。

1.3 酸枣仁皂苷回流提取的单因素试验

1.3.1 乙醇体积分数的影响 精密称取已脱脂的酸枣仁粗粉5.0 g，分别用体积分数为0，30%，50%，70%，80%和95%的乙醇为溶剂，液(mL)固(g)比10∶1，回流提取1 h，提取1次，考察不同体积分数乙醇对酸枣仁皂苷A和B总含量的影响。

1.3.2 液固比的影响 精密称取已脱脂的酸枣仁粗粉5.0 g，以体积分数70%乙醇为溶剂，液固比分别为8∶1，10∶1，12∶1，15∶1和20∶1，回流提取1 h，提取1次，考察不同液固比对酸枣仁皂苷A和B总含量的影响。

1.3.3 提取时间的影响 精密称取已脱脂的酸枣仁粗粉5.0 g，以体积分数70%乙醇为溶剂，液固比10∶1，分别回流提取1，1.5，2，2.5和3 h，提取1次，考察不同提取时间对酸枣仁皂苷A和B总含量的影响。

1.3.4 提取次数的影响 精密称取已脱脂的酸枣仁粗粉5.0 g，以体积分数70%乙醇为溶剂，液固比10∶1，回流提取1 h，分别回流提取1，2，3，4次，考察不同回流提取次数对酸枣仁皂苷A和B总含量的影响。

1.4 酸枣仁皂苷提取工艺的中心组合设计-响应面试验

在单因素试验结果基础上，以酸枣仁皂苷A和B含量之和为指标，以乙醇体积分数(X1)、液固比(X2)和提取时间(X3)为3个因素，设计中心组合试验方案(表1)。采用SAS(9.2)软件结合响应面法分析，建立数学模型，通过岭脊回归分析优选酸枣仁皂苷的提取工艺，同时采用Origin(9.0)软件制图，确定最佳提取工艺。以得到的最佳提取工艺条件进行3次平行试验，计算酸枣仁皂苷A和B的平均含量，并与模拟结果比较，验证所建立的酸枣仁皂苷提取工艺的可行性。

表1 酸枣仁皂苷提取工艺的中心组合试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of CCD design for jujuboside

1.5 数据处理与分析

采用SAS(9.2)软件进行多元线性回归、二次多项式拟合及方差分析和岭脊分析，同时采用Origin(9.0)软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁皂苷回流提取的单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数的影响 由图1可见，用70%乙醇作为提取溶剂时，酸枣仁皂苷A和B的总含量最高；乙醇体积分数低于70%时，皂苷含量随乙醇体积分数增大呈缓慢上升趋势；当乙醇体积分数高于70%时，皂苷含量随乙醇体积分数增大而减少。因此，中心组合试验中将乙醇体积分数设在50%～80%。

2.1.2 液固比的影响 由图2可见，酸枣仁皂苷含量随乙醇用量增大而增加，当液固比达到12∶1时，皂苷含量最高；液固比增加至15∶1时，皂苷含量反而有所减少；当液固比由15∶1增加至20∶1时，皂苷含量又略有增加。分析原因可能是其他非皂苷类杂质随乙醇用量的增多而溶出，致使皂苷含量相对减少。同时为节约乙醇用量，中心组合试验将液固比设在10∶1～15∶1。

图1 乙醇体积分数对酸枣仁皂苷含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on contents of jujuboside A and jujuboside B

图2 液(mL)固(g)比对酸枣仁皂苷含量的影响Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on contents of jujuboside A and jujuboside B

2.1.3 提取时间的影响 由图3可见，酸枣仁皂苷含量开始随回流时间的延长而增加，提取时间为2 h时含量最高，之后随时间延长而略呈下降趋势，可能是由于皂苷随提取时间延长而受热分解，导致含量减少。因此，中心组合试验将提取时间设在1～2 h。

2.1.4 提取次数的影响 由图4可见，酸枣仁回流提取3次时，酸枣仁皂苷含量最高，当提取4次时，皂苷含量反而略有减少，可能是因为长时间受热导致结构破坏，从而含量下降。因此，中心组合试验酸枣仁皂苷提取次数设定为3次。

图3 提取时间对酸枣仁皂苷含量的影响Fig.3 Effect of extraction time on contents of jujuboside A and jujuboside B

图4 提取次数对酸枣仁皂苷含量的影响Fig.4 Effect of extraction times on contents of jujuboside A and jujuboside B

2.2 酸枣仁皂苷提取的中心组合设计试验结果

表2 酸枣仁皂苷提取的中心组合设计试验结果Table 2 CCD matrix and results of jujuboside A and jujuboside B

由表4可知，总模型和线性项对皂苷含量具有极显著性影响，二次项对皂苷含量具有显著性影响。总模型相关系数R2=0.901 3，失拟项P>0.05，表明回归方程与实测值拟合较好。

由表5可知，由回归方程预测得到的酸枣仁皂苷最佳提取工艺为：液固比13.2∶1，体积分数70.9%乙醇回流提取3次，每次1.9 h，在此工艺条件下，酸枣仁皂苷A和B含量之和(1.296 151)约为1.30 mg/g。

表3 酸枣仁皂苷提取工艺回归模型参数的显著性检验Table 3 Significance test of coefficients in the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

注：**差异显著，(P<0.05)； **差异极显著，(P<0.01)。下表同。

Note:*significant difference,(P<0.05);**extremely significant difference,(P<0.01).The same below.

表4 酸枣仁皂苷提取工艺回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

表5 酸枣仁皂苷提取工艺模型的岭脊回归分析 Table 5 Ridge analysis for the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

2.3 酸枣仁皂苷提取工艺的响应面优化

根据酸枣仁皂苷A和B含量的二次回归模型，采用Origin(9.0)软件绘制响应面三维空间图和等高线图(图5)，以其中一个影响因素为中心值(编码水平为0)，观察其他两个因素对酸枣仁皂苷A和B含量的影响。

图5 两两因素交互作用对酸枣仁皂苷含量影响的响应面图和等高线图

由图5可见，乙醇体积分数(X1)、液固比(X2)和提取时间(X3)3个因素对酸枣仁皂苷A和B总含量具有一定的影响，且两两因素之间均呈现不同程度的正相关和负相关。当皂苷含量达到最高时，增大乙醇体积分数会抑制皂苷A和B的溶出；加大液固比也表现出皂苷A和B总含量有所降低的趋势。3个响应面图重叠可得酸枣仁皂苷A和B的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数(X1)65.8%～77.5%，液固比(X2)12.5∶1～14.8∶1，提取时间(X3)1.8～2 h。为降低能耗，节约成本，最终确定酸枣仁皂苷的最佳提取工艺为：体积分数66%乙醇，液固比12.5∶1回流提取3次，每次1.8 h。

2.4 酸枣仁皂苷提取最佳工艺的验证

以上述确定的最佳提取条件(体积分数66%乙醇、液固比12.5∶1、回流提取3次、每次1.8 h)进行3次平行试验，得到酸枣仁皂苷A和B含量之和分别为1.21，1.17，1.26 mg/g，平均含量为1.21 mg/g，与预测值(1.30 mg/g)接近，说明所建立模型可信度高。

3 结论与讨论

在本研究预试验中，分别采用了超声法、渗漉法、浸渍法、复合酶提取，以及回流提取和连续回流提取等方法，结果以乙醇回流提取酸枣仁皂苷含量最高，因此，本试验以乙醇回流提取酸枣仁皂苷。

在单因素试验中，分别考察了乙醇体积分数、液固比、提取时间和提取次数对酸枣仁皂苷A和B含量的影响，根据单因素试验结果设计中心组合试验的因素和水平，试验结果经SAS(9.2)软件分析得到的回归方程与实测值拟合良好，所建立的数学模型预测效果好，经响应面制图分析后，得到酸枣仁皂苷的最佳提取工艺为体积分数66%乙醇、液固比12.5∶1、回流提取3次、每次1.8 h，验证试验结果也表明，实测值略低于岭脊分析预测值，模型预测效果好，可用于指导酸枣仁皂苷的工业化生产。

本课题组同时还通过正交试验优化了酸枣仁皂苷A和B的提取工艺[16]，结果显示，最优工艺条件为体积分数70%乙醇、液固比12∶1、回流提取2次、每次1.5 h，此条件下酸枣仁皂苷A和B的含量之和(0.834 mg/g)明显低于本试验提取工艺中A和B的含量(1.21 mg/g)。且本试验中酸枣仁皂苷A和B的含量高于以往文献报道的采用正交试验优化工艺结果(0.774 4 mg/g)[9]。因此，运用中心组合-响应面法分析多因素影响的酸枣仁皂苷提取工艺，能建立更准确的数学模型。

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Optimization of reflux extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen by central composite design-response surface methodology

ZHU Hong-yan1,ZHANG Li-na1,LIN Hai-cheng1,WANG Yue-zhen2, WANG Guo-li1,ZHAO Yan1,GAO Yu-gang1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China; 2ChangchunMedicalCollege,Changchun,Jilin130031,China)

【Objective】 The reflux extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen was optimized by central composite design-response surface methodology to provide basis for industrial extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen.【Method】 The contents of jujuboside A and B were detected by HPLC-UV,using ethanol extraction.Different ethanol concentrations (0,30%,50%,70%,80%,and 95%),solvent-to-solid ratios (8∶1,10∶1,12∶1,15∶1,and 20∶1),extraction times (1,1.5,2,2.5,and 3 h) and extraction frequencies (1,2,3,and 4) were tested to screen value ranges.Then,central composite design (CCD)-response surface methodology was used and a predictive model was developed by SAS(9.2) software to determine the optimum extraction conditions.【Result】 The optimum reflux extraction conditions were:66% ethanol,solvent-to-solid ratio 12.5∶1,and extracted for 1.8 h and 3 times.The average content of jujuboside A and B was 1.21 mg/g,which was close to the model prediction (1.30 mg/g).【Conclusion】 CCD-response surface methodology for optimizing the reflux extraction of jujuboside A and B was reliable,and the detected content of jujuboside was close to the predicted value. The predicted extraction process was also stabled and could be used to direct the industrialized extraction of jujuboside.

jujuboside A;jujuboside B;extraction;CCD-response surface methodology

时间:2015-10-13 08:46DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.031

2014-08-28

国家公益性行业(农业)科研专项(201303111)；科技部科技支撑项目(2011BAI03B01)；吉林省科技发展计划项目(20126046)；吉林省世行贷款农产品质量安全项目(2011-Z25)；吉林省教育厅“十二五”项目(2014第60号)

祝洪艳(1982-)，女，吉林长春人，讲师，博士，主要从事中药研究与开发。E-mail:popzhy@163.com

张连学(1955-)，男，吉林长春人，教授，博士，主要从事药用植物栽培研究。E-mail:zlxbooksea@163.com

S665.109.9；R284.2

A

1671-9387(2015)11-0207-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.062.html