三角帆蚌血细胞形态观察及蚌龄和温度对其密度影响

2015-01-06彭本英袁汉文庹锐

湖北农业科学 2014年12期

彭本英+袁汉文+庹锐

摘要：研究了三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）血细胞分类、形态特征以及温度和蚌龄对三角帆蚌血细胞密度的影响。结果表明，温度和蚌龄对三角帆蚌血细胞的密度均有明显的影响，温度越高，血细胞密度越高;蚌龄越大，血细胞密度越高;三角帆蚌的血细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞、淋巴样细胞、血栓细胞，依次占血细胞总数的5.5%、56.8%、9.5%、22.5%和5.7%。

关键词：三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）;血细胞;形态;密度

中图分类号：S966.22+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）12-2857-03

Morphology and Density Effect Factors on Hemocytes of Hyriopsis cumingii Lea

PENG Ben-ying，YUAN Han-wen，TUO Rui

（School of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract： In this study， hemocyte classification， morphology of different types in Hyriopsis cumingii， and the effect of temperature and age on hemocyte concentration were studied， which would guide for the disease control of Hyriopsis cumingii. The results showed that temperature and age had significant effects on hemocyte density. The higher temperature， the higher hemocyte density， and there is the same correlation between age and hemocyte density. The haemocytes of H.cumingii were classified as 5 types based on the characteristics， amount of granule and its relative size. There were big granulocyte， small granulocyte， hyalinocyte， lymphoid-like cell and thrombocyte， which account for 5.5%， 56.8%， 9.5%， 22.5% and 5.7% respectively.

Key words： Hyriopsis cumingii Lea; hemocyte; morphology; concentration

贝类没有免疫球蛋白和淋巴系细胞，其免疫防御功能主要依赖于非特异性免疫[1]，由血细胞来行使免疫防御功能。血细胞是贝类免疫的基础，不同类型的血细胞在细胞免疫过程中具有不同的功能。三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）是我国培育淡水珍珠的主要蚌种之一，病害的发生给三角帆蚌培育造成重大的经济损失。三角帆蚌天然免疫系统是抵御外来病原微生物入侵的屏障，主要依靠血细胞的吞噬作用来完成，溶酶体酶、凝集素、抗菌肽等体液免疫因子以杀菌、促进吞噬等方式参与三角帆蚌的免疫防御。目前，国内外关于三角帆蚌的血细胞报道较少，罗文等[2]对其进行了初步研究，并将其血细胞初步分为无颗粒细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。本研究对三角帆蚌的血细胞分类形态特征及密度影响因素进行了研究，旨在为进一步深入研究三角帆蚌的免疫机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

三角帆蚌取自湖北省荆州市公安县某珍珠养殖场，为蚌龄适中、健康无病的2～5龄三角帆蚌。

1.2 方法

1.2.1 温度的设置为了研究温度对血细胞密度的影响，采用控温棒加热方式设置了12、15、18、21、24、27、30 ℃ 7个不同温度，将三角帆蚌置于其中暂养1周左右，以待后续抽取血液。

1.2.2 三角帆蚌血细胞的采集首先采用活体直接从闭壳肌抽血，由于活体直接采集，蚌两壳咬合很紧，操作些许困难。然后采用缓慢加热（每小时升温3 ℃），使水温缓慢上升到30 ℃时，加热30 min，三角帆蚌处于麻醉状态，两壳自然地微微地张开，从闭壳肌部位容易抽取血液。

1.2.3 血细胞的计数及观察血细胞大小测量、血细胞计数和Giemsa染色参照文献[3]的方法并略作改进。取血后立即滴片，待血细胞贴壁后，用滤纸将上清小心吸干，甲醇固定后空气干燥，Giemsa染色，DMXY显微镜观察并拍照。血细胞的分类、比例以及特征均以3龄三角帆蚌为研究对象。

1.2.4 统计分析采用Duncan's多重比较进行统计分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 温度对三角帆蚌血细胞密度的影响

由图1可以看出，血细胞的密度从12 ℃的1.42×106 个/mL下降到15 ℃的1.37×106个/mL，然后随着温度不断升高，血细胞密度也不断升高，30 ℃时达到最高，为2.19×106 个/mL。统计学分析表明，三角帆蚌处于12～18、21～27、30 ℃ 3个温度范围下血细胞密度差异显著（P<0.05），而在12、15、18 ℃温度下，三角帆蚌血细胞密度差异不显著（P>0.05），在21、24、27 ℃温度下血细胞密度差异也不显著（P>0.05），这说明在一定范围内随着温度的升高，三角帆蚌血细胞密度缓慢增加，但温度升高到一定值后，三角帆蚌血细胞密度则快速增加。endprint

2.2 不同蚌龄三角帆蚌血细胞密度

不同蚌龄三角帆蚌血细胞密度差异较大（表1）。由表1可以看出，随着蚌龄增长，三角帆蚌血细胞密度不断升高，5龄三角帆蚌血细胞密度显著高于2～4龄三角帆蚌（P<0.05），2龄和3龄三角帆蚌血细胞密度差异不显著（P>0.05）。4个蚌龄的三角帆蚌血细胞平均密度为2.09×106 个/mL。

2.3 三角帆蚌血细胞分类及特征

尽管三角帆蚌不同蚌龄阶段其血细胞密度差异较大，但血细胞形态及每种血细胞所占的比例变化不大。因而下面以3龄三角帆蚌为例，介绍血细胞的形态及比例。

大颗粒细胞：胞体较大，椭圆形，胞体中有许多折光性很强的圆形大颗粒，细胞直径为18.2 μm，占细胞总数的5.5%，由于大颗粒布满胞体，所以一般都看不到细胞核。

小颗粒细胞：数量最多的一类细胞，占细胞总数的56.8%。胞体圆形或椭圆形，胞体中有许多小颗粒，细胞直径为13.9 μm。细胞着色较浅，细胞核染成浅红色。

透明细胞：圆形或椭圆形，细胞很小，直径仅3.8 μm，占细胞总数的9.5%。细胞透明，胞质少且均匀，无任何颗粒，细胞核居中或偏离一侧，有1～2个细胞核。染色时着色较深，细胞核染成深红色，细胞质透明。

淋巴样细胞：细胞具有脊椎动物典型的淋巴细胞形态，呈圆形或椭圆形，直径约为16.4 μm，占细胞总数的22.5%。细胞核大，核质比大，细胞核周围仅有一薄层细胞质，细胞质透明。

血栓细胞：细胞形状变化多样，有圆形、椭圆形、梭型等形状，细胞外具有长短不一的伪足。细胞直径7.4 μm，占细胞总数的5.7%。

3 讨论

近年来，虽然对贝类特别是双壳类血细胞的形态和功能等已进行了大量的研究，但由于分类标准不一，特别是因为不同贝类的血细胞在形态上存在较大的差异，对贝类血细胞的分类迄今仍存在较大的分歧。大多数学者将贝类的血细胞分为两大类，即透明细胞（无颗粒细胞）和颗粒细胞（包括大颗粒细胞和小颗粒细胞），如贻贝（Mytilus edulis）[4]、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）、牡蛎（Crassostrea virginica）[5]、中国蛤蜊（Mactra chinensis）和紫石房蛤（Saxudomus purpuratus）[6]、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、海湾扇贝（Argopecten irradians）、虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）和毛蚶（Scapharca subcrenata）[7]。但在许多贝类中又发现了其他类型细胞，如在牡蛎和硬壳蛤的血细胞发现了纤维细胞[8]、黄砗磲（Tridacnacrocea）中观察到了桑葚样细胞[9]、褶纹冠蚌（Gristaria plicata Lea）血细胞中发现有浆细胞[10]、椭圆背角无齿蚌（Anodonta woodiana elliptica）中发现有淋巴样细胞[11]、池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）中发现有浆液细胞、淋巴样细胞、梭形细胞和血栓细胞[12]。本研究发现，三角帆蚌除了罗文等[2]报道的颗粒细胞和透明细胞外，还有淋巴样细胞和血栓细胞。虽然根据形态学方法对贝类血细胞进行分类，导致结果不一致，但由于形态学的分类方法比较简单实用，并且其他分类方法（外源凝集素标记法、单克隆抗体技术、免疫探针技术）也同样存在着缺陷。

贝类血细胞的密度在不同的物种中差别很大甚至在同一物种中也因年龄、生理状况、环境压力和研究方法的不同而变化[13，14]。例如硬壳蛤[15]和辛辣梨沟贝（Scrobicularia plana）[16]个体间血细胞密度差异很大。本研究中2～5龄三角帆蚌血细胞平均密度为2.09×106 个/mL，这与贻贝、大刀蛏（Ensis siliqua）[17]、齿蝶蚌[12]、褶纹冠蚌[18]等蚌的血细胞密度处于同一数量级。血细胞数量是贝类重要的生理指标，许多研究表明贝类血细胞密度还受温度的影响[18，19]。三角帆蚌血细胞在低温12～18 ℃之间平均密度为1.44×106 个/mL，在21～27 ℃之间血细胞平均密度为1.83×106 个/mL，30 ℃时为2.19×106 个/mL。同为淡水育珠蚌的褶纹冠蚌也有此规律，15 ℃时褶纹冠蚌血细胞密度为1.90×106 个/mL，30 ℃时血细胞密度达2.62×106 个/mL，但超过30 ℃血细胞密度反而下降[18]。在一定的温度范围内随着温度升高，贝类血细胞密度才不断上升，超过一个温度界限，温度上升，密度反而下降[19]。影响血细胞密度除了上述描述的因素外，还有病原菌的感染情况[14]，与健康的栉孔扇贝（Chlamys farreri）相比较，受感染的栉孔扇贝其血细胞密度下降了8%。虽然影响血细胞密度的因素很多，但在南美洲贻贝（Perna perna）研究发现，性别并不影响其血细胞密度[20]。

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