磷钾生物菌肥的菌种筛选及应用研究

王凡+李雪+孙芳艳+罗喆+汪建明+乔长晟

摘要：从保存的47株菌中，根据解磷和解钾能力强、菌株间无拮抗性的原则，确定了3株菌作为菌肥生产菌，分别为巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）。以3株菌作为生物菌肥生产菌株，对其进行发酵培养，将发酵液施于吊兰土壤进行植株种植试验，结果表明施肥的植株在根长、株高、叶长、鲜重等明显优于空白对照组。

关键词：菌肥;解磷菌;筛选;16S rDNA

中图分类号：Q939.96;Q8        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2763-04

Screening and Applying Strains as a Microbial Fertilizer of Phosphate and Potassium

WANG Fan1，LI Xue2，SUN Fang-yan3，LUO Zhe2，WANG Jian-ming1，QIAO Chang-sheng2，3

（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China; 2.Tianjin Peiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China;

3.Tianjin Key Laboratory of Industry Microbiology/Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract： Three strains of bacteria including Bacillus megatherium，Bacillus thuringiensis，Bacillus mucilaginosus were screened according to great capacity of solubilzing phosphorus（P） and potassium（K） from 47 strains stored in the lab. Planting effect was tested with pot culture contained the fertilizer consisting of these three strains when it was applied to chlorophytum. The results showed that the fertilizer could increase length of roots and leaves，height of plant and fresh weight.

Key words： microbial fertilizer; phosphate-solubilizing bacteria; screen; 16S rDNA

由于化学肥料或有机肥料的大量施用以及施肥结构的不合理，中国农业生态环境的污染和破坏以及土壤理化性能下降等问题越来越严重。在绿色农业已成为世界农业发展方向的今天，应大力提倡、发展和施用微生物肥料，坚持走可持续发展的道路。

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，它以多种方式参与植物体内生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要的作用[1]。中国土壤中有大量含磷矿物质存在，而可溶性磷缺乏，植物很难直接吸收利用[2]。研究表明，土壤中存在使难溶性磷溶解的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种解磷能力的微生物叫做解磷菌[3]。

硅酸盐细菌是土壤中一类能够分解硅酸盐类矿物并释放出磷、钾等元素供植物利用的细菌，同时具有固氮功能[4]。在植物根际能形成优势种，可以抑制其他病原菌的生长，达到增产的效果，其发酵液中有激素物质，代谢产物如多糖、有机酸、蛋白质等有刺激和调控作物生长的作用[5]。

利用生物菌肥将土壤中无效磷钾转变为可利用态的磷钾以供作物吸收利用，这无疑是一条新的重要的农业技术途径。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株  所用的菌株的名称和来源见表1。

1.1.2  培养基  蒙金娜无机磷培养基：葡萄糖10.0 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·4H2O 0.03 g/L，Ca3（PO3）2 5.0 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min;解钾种子培养基：淀粉5.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，K2HPO4·3H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO3 0.1 g/L，FeCl3·6H2O 0.005 g/L，pH 7.5～8.5，121 ℃灭菌20 min;解钾发酵培养基：蔗糖10.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO3 0.1 g/L，钾长石粉5.0 g/L，pH 7.2～7.5，121 ℃灭菌20 min;通用培养基：葡萄糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 6.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min;胶质芽孢杆菌培养基：蔗糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 5.0 g/L，酵母粉0.5 g/L，FeCl3·6H2O 0.02 g/L，CaCO3 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min;营养培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。endprint

1.1.3  主要仪器设备  电泳仪、基因扩增仪、立式压力蒸汽灭菌锅、凝胶分析仪、超净工作台、数显pH计、恒温振荡摇床、原子吸收分光光度计、紫外-可见分光光度计，具体情况见表2。

1.2  方法

1.2.1  解磷菌的初筛  将试验菌点接在蒙金娜无机磷平板上，5～7 d后观察，菌落周围有透明圈生成的即为解磷菌。

1.2.2  解磷菌的复筛  将初筛得到的各解磷菌1环接入蒙金娜无机磷液体培养基中，30 ℃，200 r/min，培养5 d，将发酵液以15 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用钼锑抗比色法[6]测定发酵液中速效磷含量，将各菌含磷量扣除空白值后进行排序，选出5个高效解磷菌。

1.2.3  解钾菌解钾能力的测定  按照NY 882-2004附录B的方法测定。

1.2.4  生物拮抗性  采用牛津杯法[7]将功能性强的菌株与胶质芽孢杆菌进行拮抗性筛选，培养后观察菌落周围有无抑菌圈，选出互不拮抗的功能菌株。

1.2.5  未知菌株的菌种鉴定  ①菌种初步鉴定。根据菌落形态与菌株生理生化特征，参照文献[8]对分离所得菌株进行鉴定：革兰氏染色、菌体形态镜检、淀粉水解、蔗糖发酵、葡萄糖产酸反应、V-P反应、MR反应。②16S rDNA的测序。C3解磷菌株的基因组提取参照参考文献[9]，并以1%琼脂糖凝胶电泳（110 V，35 min）验证：基因组2.0 μL，marker 3.0 μL，经EB染色10 min后，利用凝胶成像系统成像。采用购于北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司的PCR试剂盒进行PCR扩增（引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，GGTTACCTTGTTACGACTT）：94 ℃预变性2 min，扩增30轮（94 ℃变性45 s，56 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s），72 ℃延伸加时5 min，4 ℃保存。完成后每管加上样缓冲液2.0 μL，通过1%的琼脂糖凝胶电泳（120 V，35 min）检测，经EB染色10 min后，利用凝胶成像系统成像，采用购于北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司的DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，送至华大基因双向测序鉴定，将测序结果双向拼接后与NCBI数据库比对，确定菌种。

1.2.6  生物菌肥产品的制备  ①生长曲线的测定。将解磷菌接于装有100 mL通用培养基的500 mL锥形瓶中，37 ℃，200 r/min培养;定期取样，测定其OD600 nm;将胶质芽孢杆菌接于装有50 mL胶质芽孢杆菌培养基的500 mL挡板瓶中，37 ℃，200 r/min培养，定期取样，测定其OD400 nm，并确定产品菌体培养时间。②产品生物量测定。将达发酵终点的解磷菌与胶质芽孢杆菌稀释涂布于营养培养基与胶质芽孢杆菌培养基上，培养24～48 h，计数。③菌体培养与收集。将各菌按上述培养条件下培养至平稳期，将各菌发酵液等体积混合，3 000 r/min，离心8 min，收集沉淀，以与总发酵液体积相等的自来水复溶菌体，即为成品肥液。

1.2.7  植株培养试验  取300 g土壤，装于花盆（盆底打孔）中，施加肥液200 mL，待肥液浸透土壤后，将长势相当的吊兰植株幼体（无根，4片叶，叶长6 cm，平均株高6 cm，鲜重1 g）插于土中培养，每日浇水，每7 d追肥一次，同时设置空白对照组，当试验组施肥时对照组施加等量自来水。定期观察两组植株长势，测定土壤pH，45 d时观察植株，测量株高、叶长、根长、鲜重等参数，与空白对照对比。

2  结果与分析

2.1  解磷菌的初筛

按“1.2.1”操作，平板上出现透明圈的菌株为C1、C2、C3、11433、r3、r4、r8、r10、11002、11003、11008、11010、11020。

2.2  解磷菌的复筛

采用钼锑抗比色法对r3、r4、r8、r10、11002、11003、11008、11010、11020、11433、C1、C2、C3进行解磷量测定，结果见表3。确定11433、C1、C2、C3、11020为解磷菌，待做拮抗试验。

2.3  解钾菌解钾能力的测定

按照“1.2.3”所述方法对解钾菌进行解钾量的测定，结果见表4。胶质芽孢杆菌解钾率为15.43%，有解钾作用，待与解磷菌进行拮抗试验。

2.4  生物拮抗性实验

由表5可知，C1、C2与11433、C3、23575相互拮抗，根据产品功能定位，最终确定11433、C3、23575为目标菌株。

2.5  未知菌株16S rDNA鉴定

2.5.1  菌种初步鉴定  对筛选得到的解磷菌株C3进行初步鉴定，试验结果见表6。根据试验结果，将C3菌株初步归为苏云金芽孢杆菌类群。

2.5.2  16S rDNA测序  提取菌株基因组后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，在约1 500 bp处出现明显特征条带，将DNA进行PCR扩增、纯化、测序，测序后拼接结果经在NCBI上比对分析，此菌与Bacillus thuringiensis Bt407同源性最高，二者在发育树上处于同一个分支上。根据文献[10]，确定C3为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

根据微生物肥料生物安全通用技术准则（NY 1109-2006）规定，苏云金芽孢杆菌（C3）、巨大芽孢杆菌（11433）、胶质芽孢杆菌（23575）的安全分级均为第一级，为可免做毒理学试验的菌种，直接用于生产。endprint

故将菌肥生产菌株确定为苏云金芽孢杆菌（C3）、胶质芽孢杆菌（23575）、巨大芽孢杆菌（11433）。

2.6  生物菌肥产品的制备

2.6.1  生长曲线的测定  按照“1.2.6”所述方法，对3菌进行生长曲线的测定与绘制，如图1所示。由图1可知，11433与23575在15 h左右进入平稳期，C3在18～19 h进入平稳期，为获得最大的菌体量，选择11433与23575培养16 h，C3培养18 h。

2.6.2  发酵终点生物量的测定  根据“1.2.6”所述方法，对3菌发酵液进行涂布计数，测得此时发酵液的菌体浓度均达到108个/mL以上。

2.7  植株培养试验

采用成品肥液种植吊兰，45 d时观察吊兰长势（图2，表7），可见，施肥植株的长势明显优于空白对照，体现在叶长、根长、叶片展阔程度上。施肥植株的根系发达，叶长有明显增长，新生叶片也多于空白对照，磷钾生物菌肥对植株的生长起到了促进作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明显降低（表8），这可能是由于菌体在生长过程中分泌了酸类物质至土壤中。

3  小结与讨论

本研究从47株菌种筛选出2株解磷菌巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，同时鉴定了胶质芽孢杆菌的解钾能力。对C3的个体形态进行观察与鉴定，结合菌落形态、生理生化指标和16S rDNA序列分析，确定C3为苏云金芽孢杆菌。将此3菌进行培养并测定生长曲线，确定平稳期到达时间并以此作为培养终点，以获得较大生物量。培养后取菌体与发酵液等体积自来水混合，施于土壤，培养吊兰幼体，45 d时观察吊兰长势，其根长、叶长、叶片展阔程度与叶表光泽均表明施肥液培养的吊兰状态优于空白对照，且施加了菌肥的土壤其pH有明显的下降，说明菌体对植株的生长有促进作用，这是由于菌体在生长过程中将土壤中难溶性的磷钾分解为可被植物利用的形态，促进植株生长。并且施加了菌肥的土壤pH降低，这能否改变中国北方的盐碱性土壤有待进一步研究。

参考文献：

[1] FENG K，LU H M，SHENG H J，et.al. Effect of organic ligands on biological availability of inorganic phosphorus in soils[J].Pedosphere，2004，14（1）：85-92.

[2] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 第三版.北京：中国农业出版社，2000.

[3] 陈  凯，李纪顺，杨合同，等. 巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究[J]. 中国土壤与肥料，2010（4）：73-76.

[4] 李元芳.硅酸盐细菌肥料的特性和作用[J].土壤肥料，1994（2）：48-49.

[5] 唐  亮，张进忠，于萍萍，等. 硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J]. 山东农业科学，2008（1）：71-73.

[6] 詹如坤.土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2000.

[7] 刘冬梅，李  理，杨晓泉. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[9] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2003.

[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint

故将菌肥生产菌株确定为苏云金芽孢杆菌（C3）、胶质芽孢杆菌（23575）、巨大芽孢杆菌（11433）。

2.6  生物菌肥产品的制备

2.6.1  生长曲线的测定  按照“1.2.6”所述方法，对3菌进行生长曲线的测定与绘制，如图1所示。由图1可知，11433与23575在15 h左右进入平稳期，C3在18～19 h进入平稳期，为获得最大的菌体量，选择11433与23575培养16 h，C3培养18 h。

2.6.2  发酵终点生物量的测定  根据“1.2.6”所述方法，对3菌发酵液进行涂布计数，测得此时发酵液的菌体浓度均达到108个/mL以上。

2.7  植株培养试验

采用成品肥液种植吊兰，45 d时观察吊兰长势（图2，表7），可见，施肥植株的长势明显优于空白对照，体现在叶长、根长、叶片展阔程度上。施肥植株的根系发达，叶长有明显增长，新生叶片也多于空白对照，磷钾生物菌肥对植株的生长起到了促进作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明显降低（表8），这可能是由于菌体在生长过程中分泌了酸类物质至土壤中。

3  小结与讨论

本研究从47株菌种筛选出2株解磷菌巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，同时鉴定了胶质芽孢杆菌的解钾能力。对C3的个体形态进行观察与鉴定，结合菌落形态、生理生化指标和16S rDNA序列分析，确定C3为苏云金芽孢杆菌。将此3菌进行培养并测定生长曲线，确定平稳期到达时间并以此作为培养终点，以获得较大生物量。培养后取菌体与发酵液等体积自来水混合，施于土壤，培养吊兰幼体，45 d时观察吊兰长势，其根长、叶长、叶片展阔程度与叶表光泽均表明施肥液培养的吊兰状态优于空白对照，且施加了菌肥的土壤其pH有明显的下降，说明菌体对植株的生长有促进作用，这是由于菌体在生长过程中将土壤中难溶性的磷钾分解为可被植物利用的形态，促进植株生长。并且施加了菌肥的土壤pH降低，这能否改变中国北方的盐碱性土壤有待进一步研究。

参考文献：

[1] FENG K，LU H M，SHENG H J，et.al. Effect of organic ligands on biological availability of inorganic phosphorus in soils[J].Pedosphere，2004，14（1）：85-92.

[2] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 第三版.北京：中国农业出版社，2000.

[3] 陈  凯，李纪顺，杨合同，等. 巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究[J]. 中国土壤与肥料，2010（4）：73-76.

[4] 李元芳.硅酸盐细菌肥料的特性和作用[J].土壤肥料，1994（2）：48-49.

[5] 唐  亮，张进忠，于萍萍，等. 硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J]. 山东农业科学，2008（1）：71-73.

[6] 詹如坤.土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2000.

[7] 刘冬梅，李  理，杨晓泉. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[9] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2003.

[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint

故将菌肥生产菌株确定为苏云金芽孢杆菌（C3）、胶质芽孢杆菌（23575）、巨大芽孢杆菌（11433）。

2.6  生物菌肥产品的制备

2.6.1  生长曲线的测定  按照“1.2.6”所述方法，对3菌进行生长曲线的测定与绘制，如图1所示。由图1可知，11433与23575在15 h左右进入平稳期，C3在18～19 h进入平稳期，为获得最大的菌体量，选择11433与23575培养16 h，C3培养18 h。

2.6.2  发酵终点生物量的测定  根据“1.2.6”所述方法，对3菌发酵液进行涂布计数，测得此时发酵液的菌体浓度均达到108个/mL以上。

2.7  植株培养试验

采用成品肥液种植吊兰，45 d时观察吊兰长势（图2，表7），可见，施肥植株的长势明显优于空白对照，体现在叶长、根长、叶片展阔程度上。施肥植株的根系发达，叶长有明显增长，新生叶片也多于空白对照，磷钾生物菌肥对植株的生长起到了促进作用。

施肥后的土壤pH比未施肥的土壤pH有明显降低（表8），这可能是由于菌体在生长过程中分泌了酸类物质至土壤中。

3  小结与讨论

本研究从47株菌种筛选出2株解磷菌巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，同时鉴定了胶质芽孢杆菌的解钾能力。对C3的个体形态进行观察与鉴定，结合菌落形态、生理生化指标和16S rDNA序列分析，确定C3为苏云金芽孢杆菌。将此3菌进行培养并测定生长曲线，确定平稳期到达时间并以此作为培养终点，以获得较大生物量。培养后取菌体与发酵液等体积自来水混合，施于土壤，培养吊兰幼体，45 d时观察吊兰长势，其根长、叶长、叶片展阔程度与叶表光泽均表明施肥液培养的吊兰状态优于空白对照，且施加了菌肥的土壤其pH有明显的下降，说明菌体对植株的生长有促进作用，这是由于菌体在生长过程中将土壤中难溶性的磷钾分解为可被植物利用的形态，促进植株生长。并且施加了菌肥的土壤pH降低，这能否改变中国北方的盐碱性土壤有待进一步研究。

参考文献：

[1] FENG K，LU H M，SHENG H J，et.al. Effect of organic ligands on biological availability of inorganic phosphorus in soils[J].Pedosphere，2004，14（1）：85-92.

[2] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 第三版.北京：中国农业出版社，2000.

[3] 陈  凯，李纪顺，杨合同，等. 巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究[J]. 中国土壤与肥料，2010（4）：73-76.

[4] 李元芳.硅酸盐细菌肥料的特性和作用[J].土壤肥料，1994（2）：48-49.

[5] 唐  亮，张进忠，于萍萍，等. 硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J]. 山东农业科学，2008（1）：71-73.

[6] 詹如坤.土壤农业化学分析方法[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2000.

[7] 刘冬梅，李  理，杨晓泉. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[9] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2003.

[10] HOLT J G，KRIEGNR.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. 9th ed.Baltimore London：Williams & Wilkins Co，1994.endprint