黄芪甲苷对急性肺损伤大鼠内质网应激介导影响

张吉 臧东钰

【摘 要】 目的：探讨黄芪甲苷（ASIV）对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（ALI）的保护作用，并初步探讨其抑制内质网应激介导的细胞凋亡的作用。方法：随机将50只SD大鼠分成5组，每组10只。对照组（静注生理盐水1mg/kg），ALI组（静注LPS，5mg/kg），ASIV组（注射LPS前，给药3、6、12mg/kg ASIV连续灌胃7天）。观察注射12h后肺组织湿干重（W/D）、western blotting检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）的蛋白表达。结果：ALI组W/D值较对照组上升（P<0.01），GRP78、ChOP蛋白表达较对照组升高（P<0.01）;ASIV组W/D值较ALI组下降（P<0.01），GRP78、ChOP蛋白表达较ALI组降低（P<0.01），并呈一定的剂量依赖性。结论：黄芪甲苷对急性肺损伤大鼠有保护作用，其作用机制可能与内质网应激有关。

【关键词】 黄芪甲苷; 急性肺损伤; 内质网应激; 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）;C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）15-0019-02

Effect of Astragaloside IV on endoplasmic reticulum stress in a rat model of acute lung injury

ZHANG Ji，ZANG Dong-yu

（Department of Thoracic Surgery， Affiliated Third Hospital， Liao ning medical college， Jin zhou 121000， China）

Abstract：Objective To explore the effect of Astragaloside IV on apoptosis mediated by endouplasmic reticulum stress （ERS） in a rat model of acute lung injury （ALI） induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods Fifty SD rats were randomly divided into control group， ALI group， and ASIV group， 10 in each group. The rats in the control group were treated with normal saline. The rats in the ALI group were treated with LPS （5mg/kg）. The rats in the ASIV groups were pretreated with ASIV （3， 6， 12mg/kg） for 7days. After 12h injection， the change of wet-dry weight （W/D） were determined. The expressions of glucose-regulated protein 78 （GRP78） and C/EBP homologous protein （CHOP） were determined by Western blot. Results Compar2ed with the control group， the W/D was increased （P﹤0.01）， the expression of GRP78 and CHOP were increased in the ALI group （P﹤0.01）. Compared with ALI group， the W/D was decreased （P﹤0.01）， the expression of GRP78 and CHOP were decreased in the ASIV groups （P﹤0.01）. Conclusion Astragaloside IV has a protective effect on LPS-induced acute lung injury， which is partially via endouplasmic reticulum stress.

Keywords：Astragaloside IV; acute lung injury; endouplasmic reticulum stress; glucose-regulated protein 78 （GRP78）; C/EBP homologous protein （CHOP）

严重的创伤、外伤及大手术易并发有革兰阴性菌感染所产生的内毒素血症，肺部是最易受累的器官，容易引发急性肺损伤（actue lung injury，ALI），进一步发展可致急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。革兰阴性细菌内毒素的主要成分脂多糖（LPS）具有明显的致ALI作用。已证实在LPS引起肺的急性炎症反应中，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是内毒素源性的急性肺损伤的重要病理生理机制[2]。中药黄芪（astragalus，As） 为豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根，味甘、性温、乃补气之圣药。黄芪甲苷（Astragaloside IV，ASIV）为黄芪的有效成分之一，对ALI具有治疗作用[3]，但治疗ALI的作用机制尚不清楚。本研究通过观察ASIV干预对ALI大鼠肺内质网应激的影响，进一步明确黄芪甲苷对ALI的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 50只SD大鼠250～300g，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。主要试剂有黄芪甲苷（上海源叶生物科技有限公司，经高效液相色谱法鉴定纯度为98%，批号：CM0308QA13），内毒素LPS（美国Sigma公司，批号：L2880），组织蛋白提取试剂盒（南京碧云天公司，批号：P0013B），葡萄糖调节蛋白78（GRP78 ，批号：ab21685）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP，批号：ab11419）和β-actin（美国Santa Cruz公司，批号：sc-47778），其他均为国产分析纯试剂。

1.2 动物分组及模型制备 50只健康SD大鼠随机分成5组，每组10只。对照组（静注生理盐水1mg/kg），ALI组（静注LPS，5mg/kg），ASIV高、中、低剂量组（注射LPS前，给药3、6、12mg/kg ASIV连续灌胃7d）。各组动物取样前禁食12h，20%乌拉坦（12g/kg）腹腔注射麻醉。开胸取右前叶组织做湿干重（W/D）测定;取右肺副叶、后叶置于生理盐水中迅速漂洗干净后，立即放入液氮中冷冻，后转入-80℃冰箱内保存，用作western blotting检测。

1.3 指标测定

1.3.1 肺组织作湿干重（W/D）测定 取右前叶组织测定湿重量（wet weight，W）后，至干燥箱（80℃，24h）烤至恒重，测干质量（dry weight，D），计算肺湿干重比值。以W/D表示肺组织含水量。

1.3.2 western blotting法测定GRP78、CHOP蛋白表达 -80℃冰箱取出冻存的肺组织标本100mg加入200ml裂解液中剪碎后移入1.5ml EP管中，4℃超声粉碎，12000r/min离心30min，取上清液用于蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，半干法将蛋白质转移到PVDF膜上，恒压电泳95V，室温1h，4℃封闭过夜。将膜放入Ⅰ抗（1∶500稀释），杂交2h，封闭漂洗后将膜放入加入碱性磷酸酶标记的Ⅱ抗中（二抗均1∶500稀释），室温孵育1～2 h，漂洗后加显色剂，避光显色2～5min，条带出现，终止反应。以β-actin为内参照进行半定量灰度分析，以灰度比值表示蛋白表达强度。

1.4 统计学处理 所有数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验进行统计学处理，P <0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对肺组织W/D比值的影响 ALI组肺W/D显著高于对照组（P﹤0.01），ASIV组肺W/D较ALI组显著降低（P﹤0.01）。见表1。

2.2 黄芪甲苷对大鼠肺组织GRP78和CHOP蛋白表达影响 与对照组比较，ALI组大鼠GRP78和CHOP蛋白表达均升高（P<0.01）;与ALI组比较，ASIV组大鼠GRP78和CHOP蛋白表达均降低（P <0.05， P<0.01） ，且呈一定的剂量依赖性。（表2，图1）

3 讨论

急性肺损伤发病急而严重，发病率和死亡率都较高，尽管对其机制和治疗研究较多，但无有效手段治疗，亦无特效药。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，能够对机体造成广泛的损害和影响。当病灶或血液中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出来的大量内毒素进入血液时，能够激活多种细胞释放炎症因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等引起全身炎症反应，引起内毒素血症。感染、创伤等急性打击及伴随的失血、低氧、缺血再灌注损伤等多种ALI诱发因素引起组织细胞内质网功能状态的改变产生ERS的活化因素[1，2，4]。适量的ERS可保护细胞，但过强或持续时间过长会诱导细胞凋亡。GRP78是ERS的经典标志。在健康大鼠体内，没有或者偶见GRP78蛋白大量表达并启动ERS;持续过量的ERS可激活CHOP，并大量表达，最终启动细胞凋亡途径[5]。

中药黄芪为一味传统的补气药，含多种生物活性物质，大量临床和动物研究证实，黄芪对肺部疾病有良好的治疗作用。黄芪甲苷是黄芪中主要活性成分，研究表明黄芪甲苷对急性肺损伤有保护作用[3]。本研究结果显示，ALI组GRP78和CHOP蛋白表达量增多，经ASIV干预后GRP78和CHOP蛋白表达量降低，提示黄芪甲苷可能通过抑制GRP78和CHOP蛋白表达，改善急性肺损伤状态。

参考文献

[1]Wheeler AP， Bernard GR. Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome： a clinical review[J]. Lancet， 2007， 369（9572）： 1553-1564.

[2]严一核， 孙雪东， 邢海波， 等. 内质网应激在大鼠急性肺损伤中的意义[J].中华危重症医学杂志， 2013， 6（1）： 21-26.

[3]赵建军， 张建勇， 陈玲. 黄芪甲苷对急性肺损伤大鼠肺水通道蛋白5表达的影响[J].中国医院药学杂志， 2013， 33（5）：385-389.

[4]Shore GC， Papa FR， Oakes SA. Signaling cell death from the endoplasmic reticulum stress response[J].CurrOpin Cell Biol， 2011， 23（2）：143-149.

[5]李瑞芳， 王国贤， 康雅萍. α-硫辛酸对糖尿病大鼠内质网应激介导影响[J].中国公共卫生杂志， 2013， 29（3）： 390-392.

（收稿日期：2014.06.24）