HPLC法同时测定偏瘫口服液中阿魏酸与丹酚酸B的含量

蒋秋香 吴柳春 韦永朴

【摘要】目的：利用双波长高效液相色谱法，建立偏瘫口服液中阿魏酸、丹酚酸B的含量测定方法。方法：采用双波长HPLC法，Waters SunFire C18（4.6mm（250mm，5μm）色谱柱，柱温35℃;甲醇-01%磷酸溶液为流动相，以10mL·min-1流速梯度洗脱;阿魏酸检测波长为318nm、丹酚酸B检测波长为286nm。结果：根据回归方程，阿魏酸和丹酚酸B的线性范围分别为6152～769μg（r=09998）、2948～36850μg（r=10000）;加样回收率分别为997%（n=6）、 982%（n=6）。结论：本方法操作简单，结果准确，重复性好，可有效地提高该制剂的内在质量，也为该药品标准进一步研究，提供一个准确的参考方法。

【关键词】 HPLC;梯度洗脱法;偏瘫口服液;阿魏酸;丹酚酸B

【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）01-0007-03

HPLC with dual-wavelength simultaneous determination of two effective ingredients

in Piantan oral liquid by gradient elution

JIANG Qiuxiang  WU Liuchun  Wei Yongpu

Guangxi Liuzhou Institate for Food and Drug Control，Liuzhou 545006，China

Abstract： To establish an HPLC with dual-wavelength detection method for simultaneous determination of Ferulic acid and Salvianolic acid B in Piantan oral liquid. Methods： The quantitative analysis was carried out on a column of Waters SunFire C18（46 mm×250 mm，5 μm） by HPLC with dual-wavelength ， by a gradient elution using methanol（A） and water（B） as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1 at 35 ℃;The eluate was detected by multiple wavelength： 318 nm for Ferulic acid （0～30min），286 nm for Salvianolic acid B （30～50 min）. Results：The linear ranges of Ferulic acid and Salvianolic acid B fell within the ranges of 6152～769μg（r=09998） and 2948～36850μg（r=10000）; The average recoveries were 997%（n=6） for Ferulic acid and 982%（ n=6） for Salvianolic acid B.Conclusion： This method is simple， accurate， reliable and can be use to improve inner quality，also provides a reference standard for the quality control of Piantan oral liquid.

Keywords：Piantan oral liquid; Ferulic acid; Salvianolic acid B

偏瘫口服液由地龙、丹参、红花、川芎、王不留行和甘草六味中药组成，具有活血、驱风通络的作用，是广西柳州市中医院用于治疗偏瘫的常用院内制剂。现行质量标准比较简单，仅检查药品性状、鉴别、相对密度及pH值等，无含量测定项目。方中丹参和川芎属活血化瘀药，丹参具有活血祛瘀，养血安神，凉血消肿的功效[1]，现代药理研究其具有抗血栓、改善微循环、促进组织的修复与再生等作用[2];川芎具有活血行气、祛风止痛的功效[1]，现代药理研究其具有扩张血管、抗血栓、改善微循环等作用[3]。为此，以方中丹参有效成分丹酚酸B、川芎有效成分阿魏酸为指标成分，针对其不同的化学结构，首次采用多波长高效液相色谱法，同时检测阿魏酸、丹酚酸B的含量。

1仪器与试药

11仪器Waters 2695型高效液相色谱仪，2487型紫外检测器，Empower Pro工作站（Waters公司）;UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）;METTLER XS205电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

12试药对照品阿魏酸（批号：110773-200611）、丹酚酸B（批号：110861-200808）购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。偏瘫口服液样品3批（规格为10ml/瓶，批号20101129;20101223;20110228），由广西柳州市中医院制剂室提供，阴性样品按偏瘫口服液处方比例自配。

2实验方法与结果

21色谱条件色谱柱：Waters SunFire C18（46 mm（250 mm，5 μm），柱温35℃;以甲醇（A）和01%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱。0～22min甲醇的比例为30%;22～25min甲醇的比例为30%～40%;25～53min甲醇的比例为40%。流速10ml·min-1;阿魏酸检、丹酚酸B检测波长为分别318nm（0～30min）、286nm（30～53min）;进样量为10μl。按上述实验条件进行测定，结果理论板数以2种指标成分（阿魏酸、丹酚酸B）计均不低于5000，且2种成分都能达到基线分离，分离度大于15。

22溶液的制备

221混合对照品溶液制备分别取对照品阿魏酸、丹酚酸B适量，精密称定，加甲醇制成含阿魏酸0003mg·ml-1、丹酚酸B 015mg·ml-1的混合溶液，即得。

222供试品溶液取偏瘫口服液样品过045μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

223阴性供试品溶液取缺川芎的阴性样品和缺丹参的阴性样品，分别过045μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

23专属性试验分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进样，液相色谱图见图1。阴性样品在阿魏酸、丹酚酸B的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。

24线性关系考察分别精密吸取“221”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20、25μL进样分析，记录峰面积。以峰面积Y对进样量X（μg）进行线性回归，求得阿魏酸和丹酚酸B标准曲线的回归方程、相关系数，结果见表1。

表1阿魏酸和丹酚酸B的回归方程、相关系数和线性范围

成 分   回归方程相关系数 线性范围（μg）

阿魏酸（ Ferulic acid ）Y =548×103 X -156×104099986152～7690

丹酚酸B（ Salvianolic acid B） Y =123×103 X -569×104099992948～3685

25精密度试验精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，以阿魏酸、丹酚酸B峰面积计，RSD分别为09%，15%。表明该方法精密度良好。

26稳定性试验取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、8、12、20、24h进样测定，考察阿魏酸、丹酚酸B在室温下的溶液稳定性，记录色谱图，以峰面积进行计算，结果RSD分别为10%、22%。表明供试品溶液室温放置24h内保持稳定。

27重复性试验取同一样品各6份，分别按“222”项下方法制备供试品溶液，进样10μl，测定。结果样品中阿魏酸和丹酚酸B平均含量（n=6）分别为2635μg·ml-1，1288μg·ml-1;RSD分别为12%，15%。表明该方法重复性良好。

28回收率试验精密吸取“27”项下已知阿魏酸、丹酚酸B含量的样品5ml共6份，分别精密加入“221项下的对照品混合溶液（阿魏酸3076μg·ml-1、丹酚酸B1474μg·ml-1）5ml，按“222”项下方法操作，制备供试溶液，测定，计算回收率。结果阿魏酸和丹酚酸B的平均回收率（n=6）分别为997%（RSD=16%），982%（RSD=09%）。

29样品含量测定分别取3个批号的偏瘫口服液样品，按“222”项下制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液及混合对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，进行测定，按外标法计算含量，结果见表2。

表2偏瘫口服液中阿魏酸和丹酚酸B的含量（μg·ml-1）

批  号 阿魏酸 丹酚酸B

20101129   2635 1288

20101223   4453 2182

20110228   3096 2407

4讨论

41检测波长的选择经紫外分光光度计扫描波长，阿魏酸、丹酚酸B分别在318nm、286nm处有最大吸收，与2010年版中国药典一部川芎（阿魏酸）、丹参（丹酚酸B）的含量测定检测波长分别为321nm、286nm相符合。在试验中选择同时兼顾到2个被测成分在某单一波长下检测，结果大大降低了被测成分的检测灵敏度，甚至造成被测成分未检出的后果。故本文采用多波长测定法，分别在各被测成分紫外最大吸收波长处同时进行含量检测。这样既提高了检测灵敏度，又为测定结果准确可靠提供保障。

42流动相的选择参考中国药典及文献资料[4-5]，综合几种流动相方法分析，得出本实验流动相条件。结果表明采用本实验所采用的梯度洗脱方法，能较好的分离有效成分，且分离时间短，峰形好。

43供试品溶液的制备样品无需任何前处理，直接过滤膜即可进样分析。既操作简便，利于生产厂家半成品及成品快速检测，又消除了分析环节的一大误差因素。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M]：2010年版一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 罗彩莲.丹参的药理作用与临床应用[J].中国当代医药，2012，19（12）：11-12.

[3] 裴艳霞.川芎的药理作用及临床应用[J].中国医药指南，2011，9（34）：197-198.

[4] 刘建明，郭咏梅，周娟丽.HPLC法测定新生化颗粒中阿魏酸的含量[J].宜春学院学报，2012，3（4）：111-112.

[5] 于晶晶，徐飞鹤.RP-HPLC同时测定香丹注射液中丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B的含量[J].海峡药学，2012，2（2）：45-47.

（收稿日期：20131115）