基于代谢组学方法研究乌头碱和苯甲酰乌头原碱对BeW o细胞的毒性机制

谢辉辉谢彤徐建亚沈存思赖子娟徐牛生汪受传单进军,（南京中医药大学中医儿科学研究所,江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室,南京00）（美国加州大学戴维斯分校基因组中心,NIH西海岸代谢组学研究中心,戴维斯9566）（赛默飞世尔科技（中国）有限公司,上海006）

基于代谢组学方法研究乌头碱和苯甲酰乌头原碱对BeW o细胞的毒性机制

谢辉辉1谢彤1徐建亚1沈存思1赖子娟2徐牛生3汪受传1单进军*1,21（南京中医药大学中医儿科学研究所,江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室,南京210023）
2（美国加州大学戴维斯分校基因组中心,NIH西海岸代谢组学研究中心,戴维斯95616）
3（赛默飞世尔科技（中国）有限公司,上海201206）

以BeWo细胞建立体外胎盘模型,采用基于气相色谱与质谱联用技术（GC-MS/MS）的代谢组学方法,研究乌头碱及其代谢产物苯甲酰乌头原碱的生殖毒性机制。收集不同时间点（0,6,12,24和36 h）药物干预后的BeWo细胞裂解液,通过GC-MS/MS分析获得细胞代谢轮廓；正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）显示,BeWo细胞内代谢物在药物干预后呈动态变化。进一步通过变量重要性投影（VIP）值和单因素方差分析筛选差异性代谢物,最终鉴定出脯氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、葡萄糖、半乳糖、琥珀酸共11个差异性代谢物。经Metaboanalyst分析,主要涉及谷氨酰胺和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,赖氨酸降解,精氨酸和脯氨酸代谢,组氨酸代谢等6条代谢通路。实验结果表明,乌头碱和苯甲酰乌头原碱主要通过影响氨基酸代谢对BeWo细胞产生生殖毒性作用。

乌头碱；苯甲酰乌头原碱；气相色谱-质谱联用；代谢组学；BeWo细胞；胚胎毒性

1 引 言

附子作为中医临床常用中药,有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛作用。但附子属“妊娠禁忌药物”, 2010版中国药典同样将其归为孕妇慎用药物[1]。附子的主要毒性成分为二萜类生物碱（如乌头碱）及其相应苯甲酰代谢产物（如苯甲酰乌头原碱等）[2]。目前研究集中于附子一般毒性及炮制或配伍解毒方面,生殖毒性,尤其是对胚胎的毒性报道较少[3,4]。研究发现,乌头碱（≥5μg/mL作用48 h）对大鼠胚胎（体外培养）可产生心脏缺陷、不规则椎体和大脑畸形等严重的致畸作用[5]；对斑马鱼胚胎心脏可引起心包囊水肿、心膜出血,甚至心率失常和心跳停止[6]。但附子所涉及的生殖毒性机制及代谢通路未见详细报道。

胎盘作为母体与胎儿交换气体、营养和废物的场所,同时也是保护胚胎和胎儿免受有害物质侵害的屏障[7],因此胎盘可作为生殖毒性研究的一个有效工具[8]；由于在体实验存在获取妊娠动物困难且实验周期较长等问题,因此适宜的体外模型显得尤为重要。BeWo细胞作为毒理学研究普遍使用的人胎盘细胞系之一,保持着较多的人类绒毛膜细胞生物学特点,是开展生殖毒性研究较为理想的体外模型[9]。

代谢组学通过分析生物体整体代谢物的改变来确定药物、环境等因素所导致影响[10,11]。近年来,代谢组学在中药毒性评价方面得到越来越多的应用,但未见有从整体评价附子生殖毒性的报道[12]。本研究以BeWo细胞建立体外胎盘模型,采用气相色谱与质谱联用技术（GC-MS/MS）的代谢组学方法,从整体角度研究附子主要毒性成分（乌头碱及苯甲酰乌头原碱）对胎盘细胞的毒性及对胚胎的可能毒性机制。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

配备AS 1310自动进样器的Trace 1310气相色谱和TSQ 8000质谱仪,TG-5MS气相色谱柱（30 m× 0.25 mm,0.25μm）,SpeedVac离心浓缩仪（Thermo公司）

乌头碱（批号121026）、苯甲酰乌头原碱（批号121109）购自成都普菲德生物技术公司；1,2-13C-肉蔻酸、BSTFA（含1％TMCS）、C8-C40烷烃系列标准品、吡啶、甲氧胺（Sigma公司）；F-12K培养基、胎牛血清（Gibco公司）；胰酶/EDTA溶液、青霉素/链霉素溶液（Wisent公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）。

2.2 细胞实验

BeWo细胞系购自中国典型培养物保藏中心,细胞培养于含有10％（V/V）胎牛血清的F-12K培养基中（含100 U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素）。培养瓶置于5％CO2,37℃培养箱。获得足量细胞后,以每孔2×105密度种植细胞于6孔板中,待细胞达到90％汇合率时,分别给予5μg/mL的乌头碱及苯甲酰乌头原碱DMSO溶液。在6,12,24和36 h分别弃培养液,生理盐水冲洗2遍后,迅速加入液氮约3 mL进行淬灭,待液氮挥发后加入300μL纯水,样品制备前于-80℃保存。

2.3 样品制备

上述样本经历3次冻融循环（-80℃冰冻60min,37℃融化30min）后,反复冲洗10遍以保证细胞分离。取上述提取液20μL用于BCA法蛋白定量后,剩余约280μL提取液,加入900μL甲醇溶液（含内标1,2-13C-肉蔻酸22.5μg）,涡旋5min后,离心（15000 r/min,10min）,取450μL上清液于离心浓缩仪挥干（45℃,14 Vac,～2 h）。

向上述样本中加入30μL甲氧胺吡啶溶液（10mg/mL）,涡旋1min后振荡1.5 h（30℃, 600 r/min）；加入30μL BSTFA（含1％TMCS）溶液后,涡旋1min后振荡0.5 h（37℃,600 r/min）,取上清液50μL用于GC-MS/MS分析。

2.4 色谱-质谱条件

载气为氦气,流速为1.2 mL/min,采用分流模式,进样口温度为250℃,分流比为20∶1,升温程序：起始温度60℃,保持1min后,以20℃/min升至320℃后,保持5min；进样量为1μL。采用EI源,离子源温度为280℃,离子传输线温度为250℃,电离能为70 eV,采集范围为m/z 50～500,采集时间3.5～19min。

2.5 数据处理

对得到的原始文件采用Xcalibur 2.2进行预处理,并通过内标归一化,得到适合SIMCA软件分析的三维矩阵数据集,坐标分别为：推测化合物,样品名及峰面积比率。采用PASW Statistics 18（SPSS公司）和SIMCA 13.0（Umetrics公司）进行单因素方差分析及OPLS-DA分析。使用NIST 2014数据库和已有标准品对其进行验证。

3 结果与讨论

3.1 GC-MS/MS分析结果

不同时间点的细胞裂解液GC-MS/MS分析总离子流图（TIC）见图1。扣除衍生化试剂背景后,共筛选出色谱峰72个。利用NIST数据库对GC-MS/MS数据分析,根据匹配度、可能性和相关化合物保留指数（RI）,推测出41种化合物,包括脯氨酸、甘氨酸、苏氨酸等多种氨基酸,葡萄糖、半乳糖、果糖等糖类以及琥珀酸、柠檬酸、尿素、肌醇、棕榈酸、硬脂酸等多种小分子代谢物。

3.2 BeWo细胞代谢轮廓分析及差异性代谢物鉴定

采用Xcalibur处理各组细胞裂解液中筛选的72种共有色谱峰,再进行正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）,由OPLS-DA得分图（图2）可见,在干预6 h后,乌头碱组和苯甲酰乌头原碱组样本已可以同0 h时样本区分,在干预24 h、36 h可以同0 h、6 h及12 h样本良好区分,提示BeWo细胞代谢物在乌头碱及苯甲酰乌头原碱干预后不同时间点有明显差异,在干预6 h和12 h已经表现出毒性,在干预24 h和36 h毒性较为严重。通过VIP＞1及单因素方差分析（p＜0.05）筛选,共找出对得分图区分做出主要贡献的差异性代谢物共12种（见图1）,并用标准品对脯氨酸、甘氨酸、苏氨酸、琥珀酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、葡萄糖进行了确认。

3.3 代谢通路分析

图1 空白组（0 h）、乌头碱（A）和苯甲酰乌头原碱（BA）干预后不同时间点（6,12,24和36 h）的BeWo细胞的GC-MS总离子流图Fig.1 TIC of BeWo intracellularmetabolites from blank group,aconitine and benzoylaconine treated groups at different time point（6,12,24 and 36 h）差异性代谢物（metabolites）：1.脯氨酸（Proline）,2.甘氨酸 （Glycine）,3.苏氨酸（Threonine）,4.琥珀酸（Succinic acid）,5.谷氨酸（Glutamic acid）,6.未鉴定（Unknown）,7.乙酰谷氨酰胺（N-Acetylglutamine）,8.谷氨酰胺（Glutamine）,9.赖氨酸（lysine）,10.组氨酸（Histidine）,11.葡萄糖（Glucose）,12.半乳糖（Galactose）。1-5,8,9,11经标准品鉴定（identified by standard substances）。

图2 乌头碱组（A）和苯甲酰乌头原碱组（BA）在不同时间点OPLS-DA得分图（R2X=0.861,Q2=0.438）Fig.2 Orthogonal partial least squares-discriminate analysis（OPLS-DA）score plot of time-dependent metabolic profiles in aconitine（A）and benzoylaconine（BA）treated group（R2X=0.861,Q2=0.438）

乌头碱、苯甲酰乌头原碱干预后不同时间点BeWo细胞内差异性代谢物的相对含量变化见图3,这些内源性代谢物含量的变化可能导致了乌头碱和苯甲酰乌头原碱对BeWo细胞的毒性。使用Metabo-Analyst3.0进行代谢通路分析。根据通路影响值＞0.1得到：（1）谷氨酰胺和谷氨酸代谢,（2）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,（3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,（4）赖氨酸降解,（5）精氨酸和脯氨酸代谢, （6）组氨酸代谢,共6条相关代谢通路。上述通路与差异性代谢物之间的联系见图4。

由图3可见,上述差异性代谢物在干预后6,12 和24 h,大部分出现明显下降,尤其以葡萄糖、半乳糖和甘氨酸、赖氨酸最为明显；但在干预36 h后,糖类含量仍明显下降,而大多数氨基酸反而出现含量增加。此现象可能与同时涉及氨基酸代谢和糖类代谢中能量供应受损有关。糖类含量明显降低,使得蛋白质分解为氨基酸,进而提供能量,从而引起干预后期大多数氨基酸的含量升高。

在干预6,12,24和36 h后,琥珀酸含量持续降低,同样提示乌头碱及苯甲酰乌头原碱可以引起细胞能量供应受损[13]。胎盘和胚胎代谢旺盛,可能因为能量代谢障碍,引起细胞凋亡和胚胎生长发育受限,甚至死亡[14,15]。而谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺作为对胎盘、胚胎及胎儿发育发挥特殊作用的一类氨基酸,其含量降低均可对胚胎产生不利影响[16～18]。图3中乌头碱可引起大部分差异性代谢物含量更显著的改变,且在部分时间点与苯甲酰乌头原碱有差异,提示乌头碱产生毒性比苯甲酰乌头原碱更强。

图3 乌头碱和苯甲酰乌头原碱不同作用时间对BeWo细胞内代谢物的影响Fig.3 Tme-dependent pattern of potential biomarkers in aconitine and benzoylaconine treated group*：与0 h比较,p＜0.05,Δ：乌头碱与苯甲酰乌头原碱比较,p＜0.05。*：Compared with 0 h group,p＜0.05；Δ：Comparison of aconitine and benzoylaconine group,p＜0.05.

4 结论

本实验采用GC-MS/MS与OPLS-DA方法分析BeWo细胞代谢物在乌头碱及苯甲酰乌头原碱干预后不同时间的动态变化,共鉴定出脯氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、葡萄糖、半乳糖、琥珀酸等11个差异性代谢物。经Metaboanalyst分析得到谷氨酰胺和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,赖氨酸分解,精氨酸和脯氨酸代谢,组氨酸代谢等6条相关代谢通路。表明乌头碱和苯甲酰乌头原碱主要通过影响氨基酸代谢对BeWo细胞产生毒性作用,推测附子的胚胎毒性可能源于其毒性成分导致的胎盘氨基酸代谢紊乱。

图4 乌头碱和苯甲酰乌头原碱对胎盘细胞内代谢物的影响及其对胚胎毒性的可能机制Fig.4 Possible mechanism of aconitine and benzoylaconineinduced placental and fetal toxicity（1）谷氨酰胺和谷氨酸代谢,（2）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢, （3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,（4）赖氨酸降解,（5）精氨酸和脯氨酸代谢,（6）组氨酸代谢。（1）Glutamine and glutamate metabolism；（2）Glycine,serine and threoninemetabolism；（3）Alanine,aspartate and glutamate metabolism；（4）Lysine degradation；（5）Arginine and prolinemetabolism；（6）Histidinemetabolism.

1 National Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of People′s Republic ofChina（2010 edition）.Beijing：China Medical Science Press,2010：177-178

国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）.北京：中国医药科技出版社,2010：177-178

2 CHEN Rong-Chang,SUN Gui-Bo,ZHANG Qiang,YE Zu-Guang,SUN Xiao-Bo.China J.Chin.Mater.Med.,2013, 38（8）：1126-1129

陈荣昌,孙桂波,张强,叶祖光,孙晓波.中国中药杂志,2013,38（8）：1126-1129

3 Tong P,Wu C,Wang X,Hu H,Jin H,Li C,Zhu Y,Shan L,Xiao L.J.Ethnopharmacol.,2013,146（2）：562-571

4 PengW W,LiW,Li JS,Cui X B,Zhang Y X,Yang GM,Wen H M,Cai BC.J.Ethnopharmacol.,2013,148（2）：579-586

5 Xiao K,Wang L,Liu Y,Peng C,Yan G,Zhang J,Zhuo Y,Li H.Birth Defects Res.B：Dev.Reprod.Toxicol.,2007, 80（3）：208-212

6 FANG Fang,ZHAO Jie,YU Lin-Zhong,LUO Jia-Bo.Pharmacol.Clin.Chin.Mater.Med.,2012,28（02）：32-34

方芳,赵杰,余林中,罗佳波.中药药理与临床,2012,28（02）：32-34

7 Caserta D,Graziano A,Lo Monte G,Bordi G,Moscarini M.Eur.Rev.Med.Pharmacol.Sci.,2013,17（16）：2198-2206

8 Myllynen P,Pasanen M,Pelkonen O.Placenta,2005,26（5）：361-371

9 Prouillac C,Lecoeur S.Drug Metab.Dispos.,2010,38（10）：1623-1635

10 SHIDong-Dong,WANG Gui-Ming,KUANG Yuan-Yuan,PENG Zhang-Xiao,WANG Yan,GU Xue,YAN Chao.Chinese J.Anal.Chem.,2014,42（6）：1088-1093

史栋栋,王桂明,况媛媛,彭章晓,王彦,谷雪,阎超.分析化学,2014,42（6）：1088-1093

11 GU Jin-Ning,NIU Jun,PIZi-Feng,Yue HAO,WU Sui-Sheng,LIU Shu-Ying.Chinese J.Anal.Chem.,2014,41（3）：371-376

谷金宁,牛俊,皮子凤,越皓,吴绥生,刘淑莹.分析化学,2013,41（3）：371-376

12 Zhang Z H,Zhao Y Y,Cheng X L,Dai Z,Zhou C,Bai X,Lin R C.J.Ethnopharmacol.,2013,149（1）：303-310

13 LEIHuan-Cheng,SONG Dao-Jiang,YI Jian-Hua,ZHU Fang-Cheng,GU Yu-Lin.Chin.J.Ind.Med.,2004,17（6）：373-374

雷怀成,宋道江,易建华,朱方成,顾玉林.中国工业医学杂志,2004,17（6）：373-374

14 Jones H N,Powell T L,Jansson T.Placenta,2007,28（8-9）：763-774

15 Kalhan SC.Am.J.Clin.Nutr.,2000,71（5）：S1249-S1255

16 Marc R J,Wu G.Amino Acids,2009,37（1）：111-122

17 Wu G.Amino Acids,2009,37（1）：1-17

18 Wu G,Bazer FW,Datta S,Johnson G A,Li P,Satterfield M C,Spencer T E.Amino Acids,2008,35（4）：691-702

（Received 23 May 2015；accepted 31 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（NO.81303299）

M etabolom ics Study of Aconitine and Benzoylaconine Induced Reproductive Toxicity in BeW o Cell

XIE Hui-Hui1,XIE Tong1,XU Jian-Ya1,SHEN Cun-Si1,LAIZi-Juan2,XU Niu-Sheng3, WANG Shou-Chuan1,SHAN Jin-Jun*1,21（Jiangsu Key Laboratory ofPediatric Respiratory Disease,Institute ofPediatrics in Chinese Medicine, Nanjing University ofChinese Medicine,Nanjing 210023,China）
2（Genome Center ofUC Davis,NIHWest CoastMetabolomics Center,Davis95616,USA）
3（Thermo Fisher Scientific,（China）Shanghai201206,China）

An intracellular metabonomics method based on gas chromatography coupled with mass spectrometer（GC-MS/MS） was established to explore the toxicity mechanism of aconitine and benzoylaconine.BeWo,the continuous cell lines originated from human placentawere selected to establish the in vitro placentamodel.The intracellularmetaboliteswere extracted after exposed with 5μg/mL aconitine and benzoylaconine for 0,6,12,24 and 36 h,respectively.The intracellularmetabolic profiling was acquired by GC-MS/MS.Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）score plot showed the timedependent change of themetabolomics profiles between the control and intervention groups.After screened by variable influence on projection（VIP）value,one-way analysis of variance and searched with NIST 2014 database, we identified 11 metabolites, including proline, glycine, threonine, glutamic acid, N-acetylglutamine,glutamine,lysine,histidine,succinic acid,glucose and galactose,whichmainly involved these pathways：（1）glutamine and glutamate metabolism,（2）glycine,serine and threonine metabolism, （3）alanine,aspartate and glutamate metabolism,（4）lysine degradation,（5）arginine and proline metabolism and（6）histidinemetabolism.The results demonstrated that amino acid metabolism was themain metabolic pathway and responsible for the placental and fetal toxicity of aconitine and benzoylaconine.

Aconitine；Benzoylaconine；Gas chromatography-mass spectrometry；Metabonomics；BeWo cell；Fetal toxicity

10.11895/j.issn.0253-3820.150430

2015-05-23收稿；2015-08-31接受

本文系国家自然科学基金（No.81303299）、江苏省研究生培养创新工程（No.SJZZ_0124）资助

E-mail：jshan@njucm.edu.cn