无柄小叶榕耐寒性研究

张晓勉，高智慧，李明良，岳春雷，

袁信昌4，吴敏霞5，王 泳1，李贺鹏1，陈 斌4

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林业技术推广总站，浙江 杭州 310020；3. 浙江省桐庐县莪山乡人民政府，浙江 桐庐 311512；4. 浙江省舟山市农林与渔农村委员会，浙江 舟山316021；5. 浙江省温岭市林业技术推广站，浙江 温岭 317500）

无柄小叶榕耐寒性研究

张晓勉1，高智慧2*，李明良3，岳春雷1，

袁信昌4，吴敏霞5，王 泳1，李贺鹏1，陈 斌4

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林业技术推广总站，浙江 杭州 310020；
3. 浙江省桐庐县莪山乡人民政府，浙江 桐庐 311512；4. 浙江省舟山市农林与渔农村委员会，浙江 舟山316021；5. 浙江省温岭市林业技术推广站，浙江 温岭 317500）

采用人工模拟低温处理技术测定无柄小叶榕离体叶片在不同低温梯度胁迫下电解质渗出率的变化，并利用Logistic方程拟合其电解质渗出率的曲线，计算半致死温度（LT50）。结果表明：在低温胁迫处理过程中，随着温度的降低，电解质渗出率与处理温度呈负相关；电解质渗出率整体变化呈典型的“S”形单峰曲线；经显著性检验相关系数均在0.91以上，符合Logistic方程；通过方程拐点确定无柄小叶榕半致死温度为-3.95℃。

无柄小叶榕；电解质渗出率；电导法；Logistic方程；耐寒性

无柄小叶榕（Ficus concinna var. subsessilis）是小叶榕（Ficus concinna）的一个变种，在我国主要分布在浙江南部、广西、广东等省份[1~2]。无柄小叶榕树姿雄伟，长寿常绿，是优良的造林绿化树种；同时由于其优良的耐盐碱特征使其成为一种沿海防护林建设的重要树种，在我国南方的生态绿化中占据重要的位置[3]。但由于该树种主要产于我国亚热带最北缘，对于干旱和低温相对敏感，因此探讨和研究无柄小叶榕的耐寒特性和寒害发生机理对于扩大其种植面积和制定合理的抗寒措施有重要意义。

电导法结合Logistic方程判断电解质外渗与低温伤害程度的关系是测定植物耐寒性常用的方法[4]。从Dexter等使用电导法测定植物抗性以来[4]，这种方法得到了不断的完善和发展。Sukumatan等提出了电解质透出率达50%时为半致死温度的观点[5]，但半致死温度并不总是表现为电解质透出率达50%时的温度。Rajashekar C等利用Logistic曲线描述低温对植物细胞膜的伤害过程，提出曲线拐点为LT50的观点[6]，即以植物组织在一系列冰冻温度下测得的电解质透出率配以 Logistic方程，利用求拐点温度作为组织半致死温度。半致死温度在温度——细胞伤害率的“S”型曲线上表现为曲线的拐点所对应的温度，它能较直观、准确地反映植物的抗寒能力和所能耐受的低温极限，这种观点在我国得到了广泛的认同[7~11]。

本研究根据低温胁迫后细胞原生质渗透性发生变化这一原理，应用电导法结合 Logistic方程拟合求出无柄小叶榕半致死温度，从而对其耐寒性能进行初步评价分析，为其在浙江扩大栽培区域以及制定合理的抗寒措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验时间为2013年3月，实验材料来自浙江省林业科学研究院大棚中栽培的3年生小叶榕盆栽苗。实验时从盆栽苗中随机选取生长基本一致的叶片样品带回实验室进行相应实验。

1.2 试验方法

1.2.1 低温处理 取各单株成熟叶片进行低温处理．随机采取各单株位于中上部当年生侧枝上的第4、第5、第6个叶片（完整无病虫害），每个单株15枚左右。采后用湿润纱布包裹放入自封袋中密封，带回实验室，用自来水、蒸馏水和重蒸馏水冲洗干净后，用纱布擦干，各单株叶片分为3个重复（每重复5片），低温处理设为0、-2、-4、-6、-8℃ 5个温度梯度，低温处理时降温幅度为4℃/h，达到处理温度后保持24h，然后解冻（升温速度为4℃／h），解冻温度达室温（15℃）后，进行叶片受害程度观测和电导率测定。

1.2.2 电解质渗出率（相对电导率）的测定 低温处理结束后，取出试管，加入蒸馏水5 mL，真空渗入15 min，振荡一下，置25℃下放置3 h，取出再振荡一下，静置后用DDS-11A型数字电导率仪测电导率值，后置沸水浴中15 min，冷却后测煮沸电导率值，计算电解质渗出率（相对电导率，处理电导率与煮沸电导率之百分比）。1.2.3 数据处理 对实验数据（电解质渗出率）进行Logistic回归分析，Logistic方程为：

其中，y为实测细胞伤害率；t代表冷冻温度；k为细胞伤害率的饱和容量；a、b为方程参数。为确定a、b值，将Logistic方程转化为，则转化为细胞伤害率（ y'）与处理温度（t）的直线方程。通过直线回归的方法求出a、b值，对回归方程进行二阶导数变换的方程曲线的拐点值，即为半致死温度（LT50）。

2 结果与分析

2.1 不同低温处理对无柄小叶榕形态变化的影响

不同低温处理后小叶榕叶片样品于室内静置12 h后，观察其形态变化，结果见表1。从表1可以看出，不同低温处理条件下小叶榕叶片受伤害程度差异比较明显。总体表现为：0和-2℃处理后，冻害不明显；-4℃处理后产生冻害；-6℃处理后有明显冻害；-8℃处理后有严重冻害。

2.2 不同低温处理对无柄小叶榕叶片电解质渗出率的影响

表1 叶片冻害程度形态观察Table 1 Morphological changes after different cold stress

低温造成膜伤害的结果是膜渗透性的改变和丧失，细胞内物质大量向外渗透，并最终引起细胞的死亡。电解质渗出率可以反映组织伤害的程度和植物抗寒能力的高低[8]。

从图1可以看出，整个电解质渗出率的变化趋势呈缓慢、急剧、再缓慢的“S”型变化趋势，处理温度与电解质渗出率之间呈显著负相关，平均相关系数达-0.932。有研究表明，低温使膜透性呈可逆性增加时，是叶片细胞对低温刺激的一种适应性反应；当它呈半可逆增加时，则是细胞遭受伤害的标志；呈不可逆增加时，则是细胞因冷致死的结果[13]。

从整个低温处理过程来看，在 0℃时，电解质渗出率平均值为26%，说明细胞膜已有部分破坏。从0℃到-2℃过程中，电解质渗出率降低，原因可解释为在刚开始一段时间内植物细胞膜受到一定程度的破坏，而后由于植物对低温胁迫产生了一定的防卫反应，特别是保护酶系统和渗透调节等适应性防御反应在一定程度上维持膜结构的稳定性，使电解质渗出率有所降低。但当温度在-2℃到-6℃过程中，随着温度的继续降低，低温胁迫超出了植物细胞的防卫反应能力，使植物细胞膜破坏加强，导致细胞电解质渗出率急剧上升[14]。当温度低于-6℃时，细胞电解质渗出率增速变缓，说明膜透性几乎完全被破坏[15]。

图1 不同温度梯度小叶榕叶片电解质渗出率Figure 1 Electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilistreated with different temperature

2.3 低温处理条件下无柄小叶榕电解质渗出率Logistic回归模型建立及抗寒性能分析

半致死温度是植物抗寒性强弱的重要参考指标，某植物的半致死温度只有低于或等于该地区的最低温度时，该植物才能正常越冬。因此，对植物组织进行人工低温处理，通过分析不同温度下的电解质渗出率值，模拟出相应的 Logistic回归方程，能较好地反映出该植物的抗寒能力[16]。朱根海等在研究不同低温处理盆栽小麦的变化情况时发现，其电解质渗出率曲线呈“S”形，认为应用电导法配合 Logistic方程求出“S”形曲线的拐点温度能较准确地估计出植物组织的低温半致死温度（LT50），而且LT50可作为植物抗寒性的重要指标之一[9]。Logistic方程是一个典型的“S”曲线方程，在数学上拐点即时的值，即为LT50。莫惠栋利用方程回归统计法对温度和电解质渗出率进行Logistic回归分析，计算出LT50，并进行拟合度检验，认为可以很好的估计出植物组织的低温半致死温度[17]。

本研究以0、-2、-4、-6、-8℃人工低温处理条件下，各无柄小叶榕离体叶片的电导率数值为依据 ，建立无柄小叶榕叶片电解质渗出率的回归方程（表 2）。从表 2可以看出，在低温胁迫下，电解质渗出率与温度之间的关系曲线，能较好地用Logistic曲线方程进行拟合，拟合度都在0.91以上，达到显著水平。说明在本研究中，不同低温处理的电解质渗出率遵循 Logistic方程的变化规律，与半致死温度呈线性关系，且拟合结果可靠，精确度较高。通过对三个重复得到的半致死温度的平均可以得出无柄小叶榕低温的LT50为-3.95℃。将各重复半致死温度代入拟合方程可得出拐点温度时细胞伤害率，经过计算三个重复细胞伤害率的平均值为50%。

表2 不同低温下无柄小叶榕电解质渗出率拟合Logistic方程及LT50Table 2 Fitted logistic equation and half lethal temperature(LT50) for electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilis treated with different temperature

3 结论与讨论

细胞膜是生物体与环境之间的界面结构，对维持生物体正常的生理生化过程有重要的作用。细胞膜是细胞感受环境胁迫最敏感的部位[18]也是低温伤害的初始部位[19]。Lyons[20]认为，冷敏感植物在遭受低温胁迫时，生物膜首先发生物相改变，由液晶相变为凝胶相，生物膜的透性发生不同程度的增大，细胞内的电解质外渗，引起导电性的变化，根据细胞导电性的差异，确定膜透性大小，从而推测膜的受伤程度和对寒冷的抗性强弱。电导法就是依据此原理检测植物的抗寒性，并以相对电导率拟合Logistic方程求得LT50，以此比较植物在低温下保持膜系统稳定性和完整性的能力判断植物抗寒能力强弱[4]。

本实验利用0、-2、-4、-6、-8℃ 5个温度梯度对无柄小叶榕电解质渗出率进行测定。研究表明，电解质渗出率与处理温度呈显著负相关，整个电解质渗出率的变化趋势呈缓慢、急剧、再缓慢的“S型变化趋势。当温度在-2℃到-6℃过程中，植物细胞膜破坏加强，细胞电解质渗出率急剧上升。当温度低于-6℃时，细胞电解质渗出率增速变缓，说明膜透性几乎完全被破坏。

有研究表明，植物组织遭受低温胁迫时，膜透性发生变化，伤害程度不同，膜透性变化不同，但在轻度伤害时膜的透性是可恢复的。低温对细胞膜伤害存在一个临界温度，低于临界温度时，对膜结构的破坏是可逆的[21]。在本研究中，在0℃到-2℃过程中，细胞电解质渗出率呈下降趋势，-2℃时质膜伤害率低于0℃，这就是植物在初遇低温时自我保护机制起作用的结果。

用电导法配合 Logistic方程计算材料的半致死温度比较简便，而且可靠性强，现已应用于多种植物材料耐寒性的测定[22~23]。本研究以小叶榕成熟叶片为材料，严格控制低温处理和材料浸提的温度与时间，然后利用低温处理后的电解质渗出率值拟合Logistic方程，最后采用拐点法求得无柄小叶榕的半致死温度为-3.95℃。但需要说明的是，在自然生长状态下，植物体的生理状况会随外界环境因素的变化而发生改变，并会产生一系列适应性变化，逐渐形成其抗寒性[24]。人工低温胁迫下，通过相对电导率来判断植物的被伤害程度与抗寒能力，忽略了很多外来影响因素。因此，本研究所得到的叶片LT50，只是判别抗寒性差别的依据之一。要更为准确地对无柄小叶榕的抗寒能力做出科学判断，不仅需要进行生理生化方面的多指标综合分析，还需要进行自然状态下的生理指标测定和低温胁迫后恢复生长试验等后续研究[25]。

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Determination of Cold Resistance of Ficus concinna var. subsessilis by REC with Logistic Equation

ZHANG Xiao-mian1，GAO Zhi-hui2*，LI Ming-liang3，YUE Chun-lei1，YUAN Xin-chang4，WU Min-xia5，WANG Yong1，LI He-peng1，CHEN Bin4

（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang Forestry Extension Station, Hangzhou 310020, China; 3. E’shan Township Government of Tonglu, Tonglu 311512, China; 4. Zhoushan Agro-forestry, Fishery and Rural Area Committee, Zhoushan 316021, China; 5. Wenling Forestry Extension Station of Zhejiang, Wenling 317500, China）

Electrolyte leakage in leaves of Ficus concinna var. subsessilis were determined under simulated low temperature and Logistic equation was fitted with curves of electrolyte leakage for calculating semi-lethal temperature (LT50). The results showed that electrolyte leakage rate had negative relation with decrease of temperature and the curve showed a typical“S”shape. Correlation coefficient was above 0.91 after test of significance, which met with logistic equation. LT50of F. concinna var. subsessilis was -3.95℃.

Ficus concinna var. subsessilis; electrolyte leakage rate; relative electric conductivity; Logistic equation; cold resistance

S718.51

A

1001-3776（2015）03-0026-05

2015-01-04；

2015-04-18

浙江省科技厅院所专项“千里沿海基干林带建设关键技术研究与集成示范”（2012F30020）；浙江省林业厅省院合作项目“小叶榕耐寒种质资源的引选研究与示范”（2011SY04）、浙江省林业厅推广项目“沿海基干林带建设关键技术推广与示范”（2012B32）

张晓勉（1983-），男，河南南阳人，助理研究员，博士，从事森林生态等研究；*通讯作者。