桧木醇激活膀胱癌J82细胞自噬诱导细胞凋亡

大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁 大连 116023

桧木醇激活膀胱癌J82细胞自噬诱导细胞凋亡

高玉仁，张德福，王梁，刘志宇

大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁 大连 116023

背景与目的：膀胱癌是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升，严重威胁着人类的健康。本研究旨在探讨桧木醇对人膀胱癌J82细胞增殖、凋亡及自噬的作用，并初步阐明其作用机制。方法：采用CCK-8法检测细胞的增殖活力，采用流式细胞术检测细胞的凋亡状态，采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测cleaved caspase 3、LC3及P62蛋白的表达，转染EGFP-LC3后在激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬状态。结果：桧木醇能够显著抑制J82细胞的增殖活力，通过激活caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡，Z-VAD-FMK能够部分抑制桧木醇的凋亡诱导作用。桧木醇能够激活J82细胞发生自噬，上调LC3蛋白的表达，下调P62蛋白的表达。3-MA抑制自噬之后能够部分逆转桧木醇的抗肿瘤作用。结论：桧木醇可以显著抑制J82细胞增殖并通过过度激活自噬促进膀胱癌细胞凋亡。

桧木醇；膀胱癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞自噬

膀胱癌是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升，严重威胁着人类的健康［1］。膀胱癌的复发率很高，据统计有16%～25%的复发性膀胱癌恶性程度较原发时有所增加，40%的新发膀胱癌为分化不好的高级别尿路上皮癌［2］。手术治疗是膀胱癌的主要治疗手段，表浅性膀胱癌通过手术治疗可以获得较为满意的治疗效果，而晚期膀胱癌的治疗仍是临床治疗的一大难题。所以找到一种对于膀胱癌，尤其是对中晚期浸润性膀胱癌满意的治疗方法就显得尤为紧迫。

桧木醇是一种天然化合物，从柏科植物中提取［3］。已有研究发现，桧木醇具有抗菌、抗炎、抗氧化及诱导分化等多种生物学作用［4-8］，最近的研究发现桧木醇可以导致肿瘤细胞DNA损伤，诱导肿瘤细胞凋亡［9-11］。但是桧木醇是否具有抗膀胱癌作用尚未见报道，本研究旨在进一步明确桧木醇的抗膀胱癌作用机制，为桧木醇的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人膀胱癌J82细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库；桧木醇购自美国Sigma公司；EGFPLC3质粒由日本大阪大学Tamotsu Yoshimori教授惠赠；MEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清及Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司；CCK-8购自南京凯基生物科技公司；Z-VAD-FMK及3-MA购自美国Santa Cruz公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；本研究所使用抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养及质粒转染

人膀胱癌J82细胞培养于含有10%胎牛血清的MEM培养基中，于37 ℃、CO2体积分数5%的饱和湿度培养箱中常规培养。转染时，提前24 h将细胞传代至激光共聚焦显微镜专用培养皿内，细胞贴壁后换成Opti-MEM培养基，按LipofectamineTM2000使用说明制备脂质体-质粒转染复合物，将该复合物加入细胞后轻微振荡，温育6 h后换成新鲜完全培养基，24 h后观察转染效果，给予桧木醇刺激后6 h，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照存档。

1.3 CCK-8细胞增殖实验

取对数生长期细胞传代于96孔板内，每孔100 μL细胞悬液(约7 000个细胞/孔)，待细胞贴壁后根据实验所需分别加入药物处理，培养至所需时间后，每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，放置于细胞培养箱内温育，根据培养基颜色变化适时终止反应，酶标仪450 nm比色并记录数据。

1.4 Annexin V/PI凋亡检测

常规消化细胞，离心后PBS洗涤两次，加入500 μL结合缓冲液重悬，加入5 μL的Annexin V和5 μL的PI至细胞悬液内，轻轻混匀后避光染色15 min，流式细胞仪检测，采用Flowjo软件进行数据分析。

1.5 蛋白［质］印迹法(Western blot)检测

将细胞裂解后蛋白定量，制样后取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，300 mA恒流电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用相应一抗于4 ℃下封闭过夜，本研究所使用一抗封闭浓度均为1∶1 000。第2天，TBST洗膜之后用辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温封闭1 h。TBST洗膜后，ECL化学发光，拍照存档。

1.6 统计学处理

本实验所有数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据采用χ±s 表示，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnett t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 桧木醇抑制膀胱癌J82细胞增殖，诱导J82细胞凋亡

在给予终浓度2.5 μmol/L桧木醇作用J82细胞24 h后，细胞活力明显下降(P<0.01)，并且该作用呈现明显的量效关系(图1A)。随着给药剂量(2.5、5、10和20 μmol/L)的增加，J82细胞增殖抑制率(37.2%、53.5%、87.1%和97.8%)也随之增加。

对J82细胞进行Annexin V/PI染色之后应用流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。结果表明桧木醇能够明显的诱导J82细胞凋亡，给予2.5 μmol/L桧木醇作用J82细胞24和48 h之后，细胞凋亡率分别上升至4.75%和19.29%(图1B)。

使用Western blot对凋亡相关蛋白caspase 3的活性形式cleaved caspase 3的表达量进行检测，结果显示，随着桧木醇作用时间的延长，J82细胞cleaved caspase 3的表达量明显上升(图1C)。我们进一步使用caspase的抑制剂Z-VADFMK抑制caspase活性后进行CCK-8实验，结果显示，Z-VAD-FMK(50 μmol/L，24 h)能够显著逆转桧木醇(2.5 μmol/L，24 h)对J82细胞的凋亡诱导作用(P<0.05，图1D)，说明桧木醇可以抑制膀胱癌J82细胞增殖，诱导凋亡，且该凋亡效应依赖caspase途径。

2.2 桧木醇能够诱导膀胱癌J82细胞发生自噬

EGFP-LC3这一质粒能够表达绿色荧光蛋白EGFP和LC3的融合蛋白，将该质粒转染入J82细胞，待其稳定表达后给予桧木醇(2.5 μmol/L，6 h)作用细胞，在激光共聚焦显微镜下可以观察到药物作用后的细胞内绿色荧光点呈明显的聚集分布，绿色荧光点数明显上升，差异有统计学意义(P<0.01，图2A、B)。Western blot结果显示，使用2.5 μmol/L的桧木醇作用细胞6及12 h后，细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达量较对照组明显上升，P62蛋白表达量明显下降，且该变化具有时效关系(图2C)。说明桧木醇处理后的膀胱癌J82细胞内自噬泡的数量显著增加，细胞自噬被显著激活。

2.3 桧木醇过度激活细胞自噬诱导肿瘤细胞凋亡

3-MA是细胞自噬的抑制剂，能够抑制细胞的自噬活动。我们使用3-MA抑制细胞自噬后再进行CCK-8试验，结果显示，3-MA可以部分逆转桧木醇对肿瘤细胞的作用(P<0.01，图3A)。使用Western blot进行检测发现，3-MA (2 mmol/L，12 h)作用细胞后，LC3-Ⅱ的表达量较对照组明显下降，桧木醇及3-MA联合给药的LC3-Ⅱ型的表达量较桧木醇单独作用明显下降(图3B)。Cleaved caspase 3的表达量在给予了3-MA后，也出现了明显的下降(图3C)。说明桧木醇通过过度激活细胞自噬诱导J82细胞凋亡。

图1 桧木醇抑制J82细胞增殖，诱导细胞凋亡Fig. 1 Hinokitiol inhibits proliferation and indues apoptosis of J82 cells

图2 桧木醇激活J82细胞自噬Fig. 2 Hinokitiol induces autophagy in J82 cells

图3 桧木醇通过诱导细胞自噬促进细胞凋亡Fig. 3 Hinokitiol induces cell apoptosis via autophagy induction

3 讨 论

细胞自噬是生命科学及医学领域研究的热点之一，作为细胞最基本的生理过程，自噬能够维持细胞的能量代谢及细胞内稳态。当细胞自噬发生时，自噬泡能够将待降解的物质转运至溶酶体，并与溶酶体融合成自噬溶酶体，溶酶体内的酸性水解酶将待降解的物质水解成核酸、氨基酸、糖原及脂肪酸等小分子物质，进而重新参与物质再循环或直接参与细胞的代谢供能［12］。目前已知细胞自噬与多种疾病密切相关［13］，如阿尔茨海默病、肥厚性心肌病、慢性阻塞性肺病等。细胞自噬在肿瘤中的作用目前还不是十分清楚，有假说认为生理状态下的细胞自噬能够清除细胞内能够引起DNA损伤的物质，如活性氧(reactive oxygen species，ROS)、受损伤的线粒体和错误折叠的蛋白质等，从而维持细胞基因组DNA的完整性和稳定性，进而抑制肿瘤的发生，当肿瘤形成后，肿瘤细胞能够通过细胞自噬活动获得更多的能量，反而促进了肿瘤细胞的存活和生长［14］。

细胞自噬与细胞凋亡之间的关系及具体机制目前仍不明确。目前的研究认为，当细胞自噬过度激活时，细胞内的物质由于被过度消耗，从而诱发了细胞凋亡，当细胞自噬活动受到过度抑制时，由于代谢严重障碍和合成底物严重不足，细胞也会发生凋亡［15］。本研究结果显示，在给予膀胱癌J82细胞桧木醇处理之后，能够引起细胞内EGFP-LC3荧光点数的增加和聚集，细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达量明显上升，说明细胞内自噬泡的数量显著增多。为了进一步说明细胞内自噬泡的增多是由于细胞自噬激活引起的，我们又检测了细胞自噬特异性的底物P62蛋白的表达量［16］，结果显示，P62的表达量较对照组明显下降，说明桧木醇能够显著激活肿瘤细胞内的自噬活动。在本研究中，桧木醇引起J82细胞发生细胞自噬的时间(6 h)明显早于肿瘤细胞发生细胞凋亡的时间(24 h)，为了进一步说明桧木醇引起的细胞凋亡与自噬是否有关，我们又使用3-MA抑制细胞自噬活动之后进行检测，结果表明在抑制了细胞自噬之后桧木醇对肿瘤细胞的杀伤作用能够被部分逆转，cleaved caspase 3的表达量出现了明显下降，这些结果表明桧木醇的细胞凋亡诱导作用与细胞自噬激活有关，桧木醇能够过度激活肿瘤细胞的自噬活动，从而诱发细胞凋亡。

天然植物提取物在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景，桧木醇作为其中的一员，目前的研究还不够深入，目前已知其具有抗乳腺癌、肺癌和直肠癌的作用［10-11,17］，且该作用与细胞周期阻滞、DNA损伤和细胞自噬相关。桧木醇对膀胱癌的作用还未见有报道，本研究从体外水平证实了桧木醇的抗膀胱癌作用，丰富了桧木醇的抗瘤谱，并初步说明其通过过度激活肿瘤细胞自噬诱导细胞凋亡，为该化合物的临床应用和未来开发提供了实验依据。

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Hinokitiol induces bladder cancer J82 cells apoptosis via autophagy induction

GAO Yuren, ZHANG Defu, WANG Liang, LIU Zhiyu (Department of Urology, the Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116023, China)

LIU Zhiyu E-mail: lzydoct@163.com

Background and purpose:Bladder cancer is the most common urological malignancy in our country which seriously threatens human health, and its incidence increased year by year. This study aimed to investigate the effects of hinokitiol on the proliferation, apoptosis and autophagy in human bladder cancer cell lines.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of J82 cells. Apoptosis rate was determined by flow cytometry. Cleaved caspase 3, LC3 and P62 protein expression was determined using Western blot. EGFP-LC3 microscopy assay was performed to assess autophagy.Results:Hinokitiol significantly inhibited the proliferation of J82 cells and induced cell apoptosis via caspase pathway. The apoptosis effect of hinokitiol could be partially antagonized by Z-VAD-FMK. Hinokitiol induced autophagy of J82 cells, increased LC3 expression and down-regulated P62 expression. 3-MA is able to rescue Tet-induced cell death.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of J82 cells and induce cell apoptosis via autophagy activation.

Hinokitiol; Bladder cancer; Cell apoptosis; Cell proliferation; Cell autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.008

R737.14

A

1007-3639(2015)05-0365-06

2014-12-03

2015-01-29）

刘志宇 E-mail:lzydoct@163.com