灯盏花素对脑梗死大鼠脑保护作用的影像学观察及机制研究*

夏旺旭徐 露

（1.重庆市长寿区人民医院，重庆 400012；2.重庆医科大学，重庆 400016）

·研究报告·

灯盏花素对脑梗死大鼠脑保护作用的影像学观察及机制研究*

夏旺旭1徐 露2△

（1.重庆市长寿区人民医院，重庆 400012；2.重庆医科大学，重庆 400016）

目的采用核磁共振（MRI）技术，观察灯盏花素对脑梗死大鼠的保护作用并探索其机制。方法120只SD大鼠随机分为空白组、模型组、尼莫地平组和灯盏花素组。除空白组外，其余各组动物脑制造脑梗死模型，尼莫地平组和灯盏花素组于梗死后每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg和灯盏花素4 mg/kg，模型组注射同等体积0.9%氯化钠注射液，连续4 d。缺血后24 h、48 h和96 h，用MRI对大鼠两侧纹状体区和顶颞叶区进行T1-SE及DW-EPI序列扫描，分析表观弥散系数（ADC）值的变化；并用干湿重法计算脑含水量及western法检测APQ4水平的变化。结果与模型组相比，灯盏花素组组大鼠脑缺血后24 h、48 h及96 h，左侧纹状体和顶颞叶相对ADC值著增加（P＜0.01），脑含水量及APQ4值显著降低（P＜0.01），而尼莫地平组和灯盏花素组相当（P＞0.05）。结论灯盏花素对脑缺血再灌注损伤大鼠有一定的减轻脑水肿的作用，其机制可能与抑制APQ4的表达有关。

脑梗死 灯盏花素 ADC APQ4

灯盏花素是从菊科植物灯盏花中提取的黄酮类有效成分，主要成分是灯盏乙素，具有广泛的药理活性，如改善微循环、扩张血管、增加血流量、调节血脂、抗血栓、降低血黏度等。文献研究表明灯盏花素对脑缺血再灌注损伤和心肌缺血均有保护作用。目前，利用MRI法观测灯盏花素对急性脑梗死大鼠脑水肿和脑梗死体积的作用的研究尚未见报道。为进一步揭示灯盏花素对脑梗死的影响，本研究以大鼠脑梗死为实验研究模型，观察灯盏花素对脑梗死大鼠MRI、脑水肿及APQ4蛋白的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 实验采用SPF级成年雄性SD大鼠120只，体质量（250±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 灯盏花素注射液，购至湖南恒生制药有限公司，灯盏花素注射液1 mg溶解于0.9%氯化钠注射液1 mL中。尼莫地平，购至通化神源药业有限公司。APQ4抗体购至Santa Cruz。Siemens 1.5 T磁共振仪，SynGENE凝胶成像系统等。

1.3 分组与造模 SPF级成年雄性SD大鼠120只随机分为4组：空白组（n=30）、模型组（n=30）、尼莫地平组（n=30）和治疗组（n=30）。除空白组外，采用Longa等的线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉永久缺血脑梗死模型［2］。

1.4 给药 参照文献报道［1］，治疗组按照4 mg/kg剂量每日腹腔注射灯盏花素，对照组注射0.9%氯化钠注射液1 mL。尼莫地平组每日腹腔注射尼莫地平1 mg/kg。

1.5 观察指标 1）核磁共振扫描和图像分析：MRI检测在重庆医科大学生物工程中心核磁共振室完成。梯度场设为40 mT/m，轴向的转换速率设为400 T/（m· s）。4组大鼠分别在脑梗死后24 h、48 h和96 h进行扫描。扫描使用Rat Coil，且大鼠保持在相同位置。脑梗死后24 h、48 h和96 h分别完成如下序列：T1自旋回波序列（T1SE），TR 600 ms，TE 13 ms，FOV read 50 mm，层厚1 mm，层数15层，Averages 4，Flip angle 90°，Base resolution256×256。DW-EPI序列，TR3300ms，TE99ms，层厚2 mm，层数8层，FOV read 67 mm，Averages 4，Base resolution 100×100。完成序列扫描的顺序为：DWEPI和T1-TSE。扫描后，使用ImageJ软件对图像进行分析。选取同一定位层面的扫描序列图像 （额皮质前尖部后7 mm的冠状切面）进行分析。在此层面选取缺血侧纹状体区、顶颞叶区，对侧纹状体区和顶颞叶区4个区域。然后计算4区域在缺血后24 h、48 h和96 h的ADC值。本研究采用相对ADC值进行比较以减少动物个体差异影响。相对ADC值=患侧ADC值/健侧ADC值。2）脑含水量的检测：每组于脑梗死后24 h、48 h和96 h时间点，分别处死5只大鼠，迅速取出脑组织，去除小脑、脑干和嗅球，用滤纸吸取多余水分后称其湿重。随后放入恒温电热箱中于105℃烘烤至恒重，称其干重。按照如下公式计算脑组织含水量：脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。3）脑APQ4表达的测定：每组于脑梗死后24 h、48 h和96 h时间点，分别处死5只大鼠，迅速取出脑组织，提取总蛋白。Western blot法检测APQ4蛋白的表达。Image lab软件计算目的蛋白和β-actin条带灰度值。APQ4值的表达量由目的蛋白和β-actin条带灰度值的比值表示。

1.6 统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件。实验数据以（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组纹状体区缺血后 24 h、48 h和 96 h相对ADC值比较 见表1。缺血后24 h、48 h和96 h，于纹状体区，模型组相对ADC值均小于空白组、尼莫地平组及灯盏花素组（P＜0.01），而尼莫地平组和灯盏花素组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组纹状体区缺血后各时点相对ADC值比较（±s）

表1 各组纹状体区缺血后各时点相对ADC值比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.01。下同。

组别n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白组 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 8*模型组 5 0 . 6 9 ± 0 . 0 3尼莫地平组 5 0 . 8 8 ± 0 . 0 8*0 . 9 9 ± 0 . 0 9*1 . 0 2 ± 0 . 0 6*0 . 6 2 ± 0 . 0 8 0 . 5 3 ± 0 . 0 4 0 . 9 0 ± 0 . 0 6*0 . 7 9 ± 0 . 0 7*灯盏花素组 5 0 . 9 0 ± 0 . 0 5*0 . 9 2 ± 0 . 0 3*0 . 8 1 ± 0 . 0 6*

2.2 各组顶颞叶区缺血后 24 h、48 h和96 h相对ADC值的变化 见表2。缺血后24 h、48 h和96 h，模型组相对ADC值均小于空白组、尼莫地平组及灯盏花素组（P＜0.01），而尼莫地平组和灯盏花素组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组顶颞叶区缺血后各时点相对ADC值比较（分，±s）

组别n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白组 5 0 . 9 9 ± 0 . 0 6*模型组 5 0 . 7 7 ± 0 . 0 4尼莫地平组 5 0 . 9 3 ± 0 . 0 5*0 . 9 8 ± 0 . 0 7*1 . 0 1 ± 0 . 0 8*0 . 7 5 ± 0 . 0 3 0 . 6 1 ± 0 . 0 2 0 . 9 8 ± 0 . 0 6*0 . 8 2 ± 0 . 0 5*灯盏花素组 5 0 . 9 5 ± 0 . 0 3*0 . 9 7 ± 0 . 0 5*0 . 8 3 ± 0 . 0 4*

2.3 各组脑含水量比较 见表3。缺血后24 h、48 h和96 h，模型组脑含水量值均高于空白组、尼莫地平组及灯盏花素组（P＜0.01），而尼莫地平组和灯盏花素组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组缺血后各时点脑含水量比较（±s）

表3 各组缺血后各时点脑含水量比较（±s）

组别n 9 6 h 2 4 h 4 8 h空白组 5 0 . 7 0 ± 0 . 0 3*模型组 5 0 . 8 1 ± 0 . 0 4尼莫地平组 5 0 . 7 3 ± 0 . 0 5*0 . 7 1 ± 0 . 0 4*0 . 6 9 ± 0 . 0 5*0 . 8 6 ± 0 . 0 7 0 . 8 4 ± 0 . 0 6 0 . 7 7 ± 0 . 0 5*0 . 7 4 ± 0 . 0 3*灯盏花素组 5 0 . 7 2 ± 0 . 0 4*0 . 7 5 ± 0 . 0 5*0 . 7 2 ± 0 . 0 3*

2.4 各组脑APQ4表达的测定 见表4。缺血后24 h、48 h和96 h，模型组脑APQ4蛋白的表达均高于空白组、尼莫地平组及灯盏花素组（P＜0.01），而尼莫地平组和灯盏花素组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

脑梗死后脑组织缺血、缺氧会引起脑水肿。脑水肿程度与脑梗死的损伤尤其是梗死灶大小密切相关，脑损伤严重者相应脑水肿也会严重［3］。脑水肿进一步发展就会发生神经细胞凋亡、坏死。脑水肿在脑组织损伤后立即发生，在24～72 h最为明显，持续时间约为1周［4］。脑水肿程度可以判断脑梗死后脑损伤的严重程度，在脑梗死发生初期如果能及时控制脑水肿，对疾病的转归和愈后具有重要的意义［5］。

表4 各组缺血后各时点脑APQ4蛋白的表达（±s）

表4 各组缺血后各时点脑APQ4蛋白的表达（±s）

组别n 24 h 48 h96 h空白组 5 0.046±0.022*0.044±0.023*0.047±0.020*模型组 5 0.133±0.056 0.130±0.0520.128±0.054尼莫地平组 5 0.064±0.033*0.060±0.036*0.055±0.032*灯盏花素组 5 0.060±0.028*0.056±0.027*0.050±0.025*

随着MRI技术的兴起与发展，脑水肿的程度和发展情况能够被监测。在细胞毒性水肿和神经元细胞皱缩发生过程中，ADC值是重要的敏感参数；脑缺血急性期，由于脑细胞缺血缺氧，膜去极化，细胞外水分子转移到细胞内，使得ADC值发生变化［6］。在脑缺血急性期，缺血区域的ADC值明显下降，ADC值越低表明脑损伤越严重。动物实验表明，ADC下降程度与急性脑缺血后的组织损伤程度有一定相关性［7］。DWI能反映水分子扩散特性，对水分子运动扩散十分敏感。DWI的信号直接与ADC值有关，两者信号强度相反。ADC值可通过对DWI影像物理参数的测量计算得出［8］。脑梗死大鼠纹状体和顶颞叶区的ADC变化由表1和表2可以看出，脑梗死大鼠ADC的变化为先降低后逐渐升高，这与之前的文献报道［7］相一致，说明此时脑梗死大鼠正从梗死急性期往亚急性期过度。比较模型组和治疗组大鼠，在脑梗死后24 h、48 h及96 h时间点，灯盏花素组大鼠能显著升高脑梗死大鼠纹状体和顶颞叶区的ADC值，说明灯盏花素具有降低脑梗死大鼠急性期脑水肿的作用。

APQ4蛋白是分布于胶质细胞膜区和室管膜细胞的一种双向水转运通道，它是胶质细胞-脑脊液-血管水调节和转运的重要物质［9］。APQ4与脑水肿关系密切，在脑梗死的发生和发展过程中其都有不同程度的表达。研究表明，APQ4基因敲除鼠在脑缺血后星型胶质细胞肿胀及脑组织含水量均显著低于野生型小鼠，表明APQ4与脑缺血后的脑水肿关系密切［10］。本研究结果示，在脑梗死后24 h、48 h及96 h时间点，灯盏花素能显著降低脑梗死大鼠脑含水量及APQ4蛋白的表达，说明灯盏花素可能是通过抑制APQ4的表达来减轻脑水肿。尼莫地平是公认的治疗脑梗死的有效药物，能显著改善脑水肿情况，从各项观测指标看来，灯盏花素组和尼莫地平组无显著性差异，表明灯盏花素与尼莫地平作用相似。

另外，脑梗死属中医学“中风”范畴，其病因以内伤积损为主，即脏腑失调，阴阳偏胜。活血化瘀、息风通络是“中风”主要治法之一。灯盏花素是中药灯盏花的主要有效成分，具有活血化瘀、通络止痛的作用。因此，可采用灯盏花素治疗“卒中”，这与本实验结论相符。

综上所述，通过MRI的方法，我们可以直观地发现灯盏花素对大鼠永久性中动脉梗塞模型所导致的缺血性脑损伤有明显的保护作用，其机制可能与灯盏花素抑制APQ4蛋白的表达有关。

［1］ 陈康宁，董为伟.灯盏花素注射液对脑缺血损伤的防治研究［J］.中国中西医结合杂志，1998，18（5）：684-686.

［2］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（12）：84-91.

［3］ Gerriets T，Walberer M，Ritschel N，et al.Edema formation in the hyperacute phase of ischemic stroke［J］.Neurosur，2009，111（5）：1036-1042.

［4］ Taheri S，Candelario-Jalil E，Estrada EY，et al.Spatiotemporal correlations between blood-brain barrier permeability and apparent diffusion coefficient in a rat model of ischemic stroke［J］.PLoS ONE，2009，4（8）：e6597-6605.

［5］ Sotak CH.Nuclear magnet ic resonance（NMR）measurement of the apparent diffusion coefficient（ADC）of tissue water and its relationship to cell volume changes in pathological states［J］.Neurochem Int，2004，45（3）：569-582.

［6］ Kassner A.Recombinant tissue plasminogen activator increases blood-brain barrier disruption in acute ischemic stroke：an MR imaging permeability study［J］.AJNR Am J Neuroradiol，2009，30（10）：1864-1869.

［7］ Hjort N.MRI detection of early blood-brain barrier disruption parenchymal enhancement predicts focal hemorrhagic transformation after thrombolysis［J］.Stroke，2008，39（3）：1025-1028.

［8］ Belayev L.Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Brain Res，1996，739（1-2）：88-96.

［9］ Baoxue Yang，Zsolt Zador，A Sverkman.Glial cell aquaporin-4 overpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling［J］.J Biological Chemistry，2008，283（22）：15280-15286.

［10］付雪梅，封志纯.RNA干扰介导新生大鼠星形胶质细胞水通道蛋白-4基因沉默［J］.中国循证儿科杂志，2006，1（2）：279-282.

Imaging Observations and Mechanism Research of the Protective Effect of Breviscapine on Rats with Cerebral Infarction

XIA Wangxu，XU Lu. People's Hospital of Changshou District of Chongqing，Chongqing 400012，China

Objective：To observe the protective effects and mechanism of breviscapine on rats with cerebral infarction by the means of MRI.Methods：120 SD rats were randomly divided into the control group（n=30），model group（n=30），nimodipine group（n=30）and breviscapine group（n=30）.The rats were made into cerebral infarction model，except the control group.The breviscapine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 4 mg/kg per day for 4 days after the surgery.Nimodipine group received intraperitoneal injection of breviscapone treatment with the dose of 1 mg/kg per day.The rats in the control group received the same dose of saline injection.At 24 h，48 h and 96 h after MCAO，the striatum and parietotemporal cortex were scanned with MRI，as well as the sequence of T1-SE and DW-EPI and the changes of ADC values were analyzed. The value of brain water content and APQ4 expression were calculated.Results：Compared with model group，the relative ADC value of the striatum and parietotemporal cortex in breviscapone group significantly increased（P＜0.01），and brain water content and APQ4 decreased，at 24 h，48h and 96h after MCAO（P＜0.01），and there was no difference between nimodipine group and breviscapine group（P＞0.05）.Conclusion：Breviscapone can reduce the cerebral edema after cerebral ischemia and mitigate further damage of brain.

Breviscapine；Cerebral infarction，ADC，APQ4

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0950-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.005

2015-01-16）

重庆市第六届“步长杯”脑血管病科学研究基金面上项目（BCB2012010）

△通信作者（电子邮箱：30067011@qq.com）