天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠的实验研究*

马文慧 安冬青

（新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

·研究报告·

天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠的实验研究*

马文慧 安冬青△

（新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

目的观察天香丹对动脉粥样硬化（AS）秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠血脂水平、主动脉内皮细胞的影响，探讨其抗AS秽浊痰阻证的机制。方法将12只ApoE-/-小鼠正常对照组以普通饲料喂养，48只ApoE-/-小鼠以人工气候箱模拟新疆寒燥环境，高脂饲料喂养12周建立AS秽浊痰阻证模型。造模成功后随机分为天香丹组、阿托伐他汀组、荷丹片组、模型组，灌胃12周后处死，摘眼球取血测定血脂含量，取主动脉电镜观察病理学改变。结果与正常对照组比较，模型组小鼠血清TC、LDL-C含量上升，与模型组比较，天香丹组小鼠的TC、LDL-C含量下降，TG、HDL-C含量无显著差异，透射电镜观察显示天香丹组主动脉的内皮细胞病变程度明显轻于模型组。结论天香丹可有效降低AS秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠TC、LDL-C含量，对动脉粥样硬化形成有抑制作用。

动脉粥样硬化 天香丹 秽浊痰阻证 血脂水平 内皮细胞

动脉粥样硬化（AS）是一种多种复杂因素作用于血管壁导致内皮损伤后的一系列进展性病理变化过程，是造成缺血性心脑血管病的主要病理基础。天香丹具有补气养血、活血化瘀和止血功能，有良好的耐缺氧、抗疲劳、抗老化和改善微循环等多方面作用。多年来一直在临床中用于心脑血管疾病的治疗［1］。本实验在高脂饲料喂养和利用人工气候箱模拟新疆寒燥环境建立AS秽浊痰阻证模型［2］基础上研究天香丹对模型小鼠血脂水平、主动脉内皮细胞的影响，为将此制剂用于临床防治AS及相关疾病提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级ApoE-/-小鼠60只，雄性，8周龄，体质量（18±2）g，均购自北京大学医学部动物实验室［动物质量合格许可证号：SCXK（京）2011-0012］，饲养于新疆医科大学第一附属医院医学动物实验中心。

1.2 药物 天香丹颗粒（新疆医科大学附属中医院制剂室制备，批号：新药制字ZO4000820）。阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号：03171 lk）。荷丹片（南昌济顺制药有限公司，批号：20091210）。

1.3 仪器及试剂 202-2AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；BIC400人工气候箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），LEICA DM 2500光学显微镜（德国），胆固醇（美国AMRESCO公司），猪胆盐（上海蓝季科技发展有限公司），血脂四项试剂盒（深圳迈瑞生物医疗有限公司），JEM-100CX透射电镜（日立公司）。

1.4 模型制备 12只ApoE-/-小鼠为空白对照组以普通饲料喂养，48只ApoE-/-小鼠以高脂饲料喂养和利用人工气候箱模拟新疆寒燥环境建立AS秽浊痰阻证模型，高脂饲料配方：基础饲料72.5%、猪油10%、蔗糖10%、猪胆盐0.2%、胆固醇2%、丙硫氧嘧啶0.12%、蛋黄5%、21金维他0.1%。人工气候箱系统温度设定为（6±2）℃，相对湿度控制在25%～32.8%。喂养12周后，随机从正常组抽取2只、造模组抽取8只ApoE-/-小鼠，进行主动脉组织标本检查。造模组小鼠生物表征见行动迟缓，抑郁状态，进食较少，舌质多见暗红或暗紫色，病理检查见大量粥样斑块形成，管腔明显狭窄，可见少量泡沫细胞，大量胆固醇结晶形成，证实AS秽浊痰阻证模型已制备成功。

1.5 分组及给药 将40只ApoE-/-造模小鼠随机分为天香丹组［2.7g/（kg·d）］、阿托伐他汀组［6.1mg/（kg·d）］、荷丹片组［0.67g/（kg·d）］、模型组。药物干预组剂量均根据成人临床常规用量等效换算为动物实验用量［3］，药物溶于蒸馏水，灌胃给药，每日1次，继续喂养12周。每周按体质量调整药物用量。正常对照组、模型组均给予蒸馏水0.2 mL/d。空白对照组予普通饲料喂养，置于室温（20～24℃、相对湿度40%～70%）；各组小鼠均自由饮水饮食，不限制活动。

1.6 标本采集与检测 于灌胃12周末小鼠空腹12 h后依次进行以下操作：（1）将小鼠摘眼球取血0.8 mL置于EP管中，4℃，3500 r/min离心15 min，分离血清，-20℃保存用于血清学检测，避免反复冻融。用半自动生化分析仪采用酶比色法检测血清三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）。（2）分离主动脉瓣至髂肾动脉分支动脉组织，剪取长约1 mm主动脉弓，3%戊二醛前固定，0.2 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，1%四氧化饿固定2 h，0.2 mol/L磷酸缓冲液再冲洗3次，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制成超薄组织切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液染色，置于铜网上，在JEM-100CX透射电子显微镜下60～80 kV加速电压，6000～20000放大倍率，观察主动脉内皮细胞的超微结构变化，选取典型视野拍照用。

1.7 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两间比较采用LSD法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 天香丹对AS秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠血脂水平的影响 见表1。由表1可见，与正常对照组比较，模型组小鼠的血清TC、LDL-C、HDL-C含量上升 （P＜0.01），与模型组比较，各用药组血清TC、LDL-C含量下降（P＜0.01），TG、HDL-C含量无显著影响。

表1 各组动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别 n正常对照组 8模型组 8天香丹组 8 T C T G L D L -C H D L -C 1 1 . 8 7 ± 1 . 7 8 1 . 6 4 ± 0 . 1 9 5 . 0 9 ± 1 . 0 9 2 . 0 3 ± 0 . 8 6 3 6 . 6 6 ± 1 . 9 1*1 . 2 6 ± 0 . 1 9 3 3 . 0 8 ± 1 . 6 1*7 . 6 4 ± 0 . 9 8*3 2 . 0 4 ± 0 . 9 9△1 . 4 6 ± 0 . 1 6 1 8 . 7 6 ± 1 . 4 4△8 . 5 4 ± 1 . 3 5阿托伐他汀组 8 3 1 . 6 7 ± 2 . 1 9△1 . 6 0 ± 0 . 1 5 1 9 . 1 2 ± 2 . 3 9△8 . 3 9 ± 1 . 1 3荷丹片组 8 3 1 . 3 5 ± 0 . 7 1△1 . 2 3 ± 0 . 2 2 1 8 . 6 3 ± 1 . 7 2△8 . 8 5 ± 0 . 5 6

2.2 透射电镜观察 见图1。（1）正常对照组：内皮细胞超微结构改变正常，内皮细胞为单层扁平细胞，连续性好，胞膜平整，胞浆均匀，紧贴内弹性膜，内皮细胞线粒体略肿胀，内弹性膜连续，厚度均匀；中膜平滑肌排列整齐，平滑肌细胞微丝丰富。（2）模型组：镜下内皮细胞萎缩，肿胀，隆起，脱落，坏死。内弹力膜破坏，呈乳头状增生，斑块附近可见大量红细胞；中膜平滑肌排列不整齐，形状变多角形，可见较多泡沫细胞，色质增多，脂滴增加，动脉中膜可见大量胶原纤维增生。（3）天香丹组：内皮细胞略肿胀，结构尚完整，内弹力膜完全暴露，内弹力膜完整，连接尚紧密；中膜呈纤维性增多，泡沫细胞增多，胞浆内肌丝丰富，胞浆内脂滴明显减少，胆固醇结晶少见，结构排列紊乱。（4）阿托伐他汀组：内皮细胞略肿胀，基质密度降低，管腔内可见斑块，斑块内可见胆固醇结晶，红细胞聚集，斑块内可见红细胞，纤维样包裹形成；中膜平滑肌细胞排列基本整齐，呈多角形，平滑肌细胞腔质角丰富，细胞器较丰富，弹力膜基本完整，内膜下层增厚，可见少量泡沫细胞。胞浆内可见脂滴，但胆固醇结晶少。（5）荷丹片组：内皮细胞破坏、消失，内膜可见巨大斑块黏附于上，斑块内结晶样结构，结晶体泡沫细胞，纤维素样聚集；中膜平滑肌数目减少，平滑肌细胞可见较多脂滴，平滑肌周围可见胶原纤维增生，弹力膜排列紊乱。

3 讨 论

流行病学调查显示，降低血脂会减少冠心病的发病率。血脂升高可能增加脂核体积而加重斑块不稳定性的重要因素。因此，调节血脂水平是控制AS病变进展的措施之一。血管内皮细胞层不仅是血液与组织间的屏障，而且是十分活跃的代谢及内分泌器官，VEC结构和功能的改变在心血管疾病的发生发展中起十分重要的作用。近年来，Ross提出的“损伤反应”学说认为，VEC的损伤和功能失调是AS发生的始动环节［4］。高脂血症致AS的机制主要有：促使氧自由基产生，加速低密度脂蛋白（LDL）氧化及对内皮细胞的损伤，导致内皮细胞调亡或坏死［5］促进黏附分子表达，使血中单棱细胞更多地黏附于内皮表面，向内皮下游走［6］及促进泡沫细胞形成［7］，同时脂质叉可在内皮下沉积，而启动AS过程［8］。动脉内膜受损的形态学直接表现是内皮细胞形态的改变。许多体内外实验证实，内皮损伤时，内皮细胞可释放一些生长因子．引起复杂的生物学效应，最终导致动脉壁平滑肌细胞（SMC）增殖。管壁内过量脂质不易被清除，并被SMC、单接细胞吞噬，形成泡沫细胞［9］。

图1 各组血管内皮组织结构（1500倍）

新疆地处我国西北部，少数民族聚集，气候干燥寒冷，居民多食喜羊肉，奶制品等肥甘厚腻之品。多食肥甘易伤脾胃，运化失常，脾虚湿盛，燥伤津液，炼液成痰；痰邪凝结成块，壅滞脉络；寒邪入侵，气机闭塞，则血运不畅，瘀血内生，演变成以脾虚为本，痰瘀湿浊为标的秽浊痰阻证［10］。ApoE基因缺陷小鼠由于ApoE基因敲除后，造成血浆含胆固醇丰富的残粒清除受阻，可出现高胆固醇血症，并自发地形成纤维斑块和复合斑块，是进行AS发病机制和防治研究可靠的动物模型。实验结果可见，与正常对照组比较，模型组小鼠血清TC、LDL-C含量上升，与模型组比较，各用药组小鼠的TC、LDL-C含量下降，TG、HDL-C含量无显著影响。透射电镜显示正常对照组内皮细胞超微结构改变正常，内皮细胞为单层扁平细胞，连续性好，胞膜平整，胞浆均匀，紧贴内弹性膜，内皮细胞线粒体略肿胀，内弹性膜连续，厚度均匀。中膜平滑肌排列整齐，平滑肌细胞微丝丰富。模型组镜下内皮细胞脱落，坏死。内弹力膜破坏，呈乳头状增生，斑块附近可见大量红细胞。中膜平滑肌排列不整齐，形状变多角形，可见较多泡沫细胞，色质增多，脂滴增加，动脉中膜可见大量胶原纤维增生。各用药组主动脉的内皮细胞病变程度明显轻于模型组。

本实验用药后，从调节血脂、主动脉内皮细胞完整性形态学方面显示出天香丹对AS秽浊痰阻证ApoE-/ -小鼠动脉粥样硬化形成有明显的抑制作用，为将此制剂用于临床防治AS及相关疾病提供了科学依据。

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Experimental Study of Tianxiang Dan on ApoE-/-mice with Atherosclerosis Huizhuo Tanzu Syndrome

MA Wenhui，AN Dongqing. College of traditional Chinese medicine，Xinjiang Medical University，Xinjiang，U-rumqi，830011，China

Objective：To observe the effect and the meachanism of Tianxiang Dan on atherosclerosis of Huizhuo Tanzu syndrome of ApoE-/-mice serum lipid levels and aortic endothelial cells.Methods：12 ApoE-/-mice in the normal control group，normal diet，48 ApoE-/-mice by feeding with high fat diet and the use of artificial climate box to simulate Xinjiang dry and cold environment and fed for 12 weeks to establish As Huizhuo Tanzhu syndrome model，the rats were randomly divided into Tianxiang Dan group，atorvastatin statins group，traditional Chinese medicine control group，model group.Intragastric administration for 12 weeks.The eyeball blood was collected to determine the content of lipid，the pathological changes were observed in aorta electron microscope.Results：Compared with the normal control group，model group mice increased serum TC and LDL levels.Compared with the model group，TC and LDL-C decreased in Tianxiang Dan group mice，TG，HDL content had no significant effect.TEM showed Tianxiang Dan group aortic endothelial cell lesion were significantly lighter than that of model group.Conclusion：Tianxiang Dan，effectively reducing AS Huizhuo Tanzhu syndrome mice of ApoE-/-TC and LDL-C，can inhibit the formation of atherosclerosis.

Atherosclerosis；Tianxiang Dan；Huizhuo Tanzu syndrome；Blood lipids；Endothelial cells

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0377-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.001

2014-12-23）

国家自然科学基金资助课题（81160428）

△通信作者（电子邮箱：andongqing@sina.cn）