菌落总数测试片研究进展

白 阳（国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心，广东 广州 510530）

菌落总数测试片研究进展

白 阳
（国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心，广东 广州 510530）

菌落总数作为判定食品被污染程度的标志，具有重要的卫生学意义。菌落总数测试片具有携带方便、不用配制培养基的优点，是一种新型的检测工具。近年来专家学者围绕菌落总数测试片进行了相关研究。对这些研究进行分析和综合，具有一定的理论价值和现实指导意义。

菌落总数；测试片；研究进展

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全关系到人们的健康和国计民生，已经越来越受重视。随着社会的进步，人们的生活水平不断提高，有关部门加大了食品安全方面的执法力度，其中菌落总数是食品卫生检验中最基本、最常见的微生物指标检测项目。国际微生物规格委员会将菌落总数定义为在被检样品的单位重量（g）、容积（mL）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。菌落总数是判定食品被细菌污染程度的重要标志，能反映食品加工及储藏过程是否符合食品卫生要求。通常认为，食品中细菌数量越多，致病菌污染的可能性越大。菌落总数还可用于观察食品中微生物的性质以及微生物在食品中繁殖的动态，以便在对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。近年来，随着环境污染的加剧和生态平衡的破坏，人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大，因此，采用适当的检验方法对食品菌落总数进行检测，是预防食源性中毒的重要手段。

1 食品中常见的微生物

引起食品污染的微生物种类繁多。有的是在食品加工过程中被外界污染的细菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等；有的是新鲜食品上正常的菌群在加工过程中残留下来的微生物，如乳酸菌等；有的是食品工业上重要的发酵菌，如酵母菌等。某些残留的细菌不仅可能引起食品腐败变质，还可能引起疾病。目前食品中常见的微生物有19个种属，具体见表1。

表1 食品中常见的微生物菌属

续表1

2 菌落总数传统检验方法

目前国内食品中的菌落测定主要是按GB／T 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》标准进行，采用平板计数法。根据样品的实际污染情况，对样品进行 10倍递增稀释，选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取 1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿；将融化并冷至 45～50℃的平板计数琼脂培养基倾注到各平皿内，每皿15～20 mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置于36±1℃培养箱内培养 48±2 h；另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入 15～20 mL平板计数琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置于36±1℃培养箱内培养 48±2 h，作为空白对照；按照 GB／T 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》标准进行结果判定。一般来说，传统培养基成本较低，但采用传统方法进行菌落总数测定存在明显不足［1］：一是培养基制备、仪器清洗、灭菌都需要较多的时间和人力，费时费力；二是由于传统方法一般需要较长时间，且需要特定的温度，对实验室仪器及无菌条件要求较高，不适合野外操作；三是传统培养方法中如果培养基的温度过高，容易使待测样品中的微生物因不适宜而受损，从而影响测定结果的准确性。

3 菌落总数测试片

随着检测技术的不断发展，先进的检测方法不断出现。目前美国 3M公司的菌落总数测试片法在世界各地使用得比较多。菌落总数测试片是指以灭菌滤纸、无纺布或冷水可溶凝胶等吸收培养基作为载体，将特定的培养基和显色物质附着在载体上面，通过微生物在其上面的生长、显色情况来测定食品中微生物的一种产品。菌落总数测试片的显著优点［2］：第一，可测定少量检品，不需要配制试剂和大量的玻璃器皿，操作简便，经济，实用；易于消毒保存，携带方便，价格低廉，能大大减少或消除对环境的污染，能减少试验后的清洗工作，能克服热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷，故适用于实验室、生产现场和野外工作环境。第二，可以在取样的同时接种，结果更能真实地反映当时样本中的细菌数，防止由于细菌繁殖造成的数量增多。第三，不用进行使用前的准备工作，能大大节省时间、人力和物力。

3.1 菌落总数测试片研究进展

3.1.1 菌落总数测试片载体

目前，滤纸、无纺布和冷水可溶性凝胶是 3种最常见的载体［3］。

滤纸。由于滤纸具有较大的间隙，用滤纸作载体，滤纸双面和纤维之间容易有菌落生长，使肉眼无法准确判断，所以测定结果一般比实际菌数要少；滤纸保水性差，检验培养时又不能保持充分湿度，不利于菌体生长；滤纸检验卡存在营养物质分布不均匀的问题，加样也不能迅速扩散，致使菌体生长分布不均匀；由于显色指示剂系统单一，不能有区别地对细菌进行计数，对真菌更差，所以很难全面推广。

无纺布。无纺布是以纺织纤维为原料，经过黏合、熔合或其他化学、机械方法加工而成的纺织品。无纺布有薄型和厚型两大类，可用以制成有透气、防毒和加速扩散等特殊用途的材料。德国拜发公司的RIDA®COUNT微生物菌落计数板和日本 CHISSO公司的SANITA-KUN微生物快速检测片，都是以无纺布为载体的新型检测片。无纺布加样后能迅速扩散，菌体生长分布均匀；但无纺布和滤纸型菌落总数测试片都不能挑菌作进一步实验，因而影响其应用前景。

冷水可溶性凝胶。冷水可溶性凝胶结构稳定、透明、回收率高，且可进行挑菌，方便对微生物做进一步鉴定，使得此类测试片的综合评价较高，具有广阔的应用前景。冷水可溶性凝胶剂一般不是微生物的营养成分，只起固化或黏合作用。3M公司的菌落总数测试片就是以冷水可溶性凝胶为载体的。理想的凝胶剂应具备以下条件：不会被微生物分解利用，不会因高温灭菌而受到破坏，在微生物生长的温度范围内保持固体状态，对微生物及操作人员均无毒害作用，透明度好、凝固力强、价格低廉、配制方便。常见的凝胶剂有琼脂、羧甲基纤维素钠、明胶、丙烯酸钠等［4］。目前关于测试片中凝胶剂的报道较少：国外，仅在美国的专利中报道过瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、聚丙烯酸系高分子化合物等，但报道得并不明确，也不系统；国内，广东环凯微生物测试科技有限公司研制的聚丙烯酸钠可以作为菌落总数测试片的凝胶剂。

3.1.2 菌落总数测试片显色培养基

一般的显色培养基由营养物质、诱导剂和显色剂组成。目前有关菌落总数显色剂的报道比较单一，主要集中在氯化三苯四氮唑（TTC）和噻唑蓝（MTT）上。TTC是目前最常用的显色剂，并已成功应用到菌落总数测试片上。TTC是一种氧化剂，细菌细胞内具有脱氢酶，在细菌脱氢酶的作用下，TTC接受氢（H）成为红色而稳定的三苯甲臜，使菌落呈现红色，在细菌培养中，细菌在一定浓度TTC的培养基中生长而形成的菌落呈现红色。在菌落总数测试片中形成红色点状物，出现在测试片之上，红点的总数就是细菌的总数，这样计数更加准确。据报道，TTC浓度过高会对细菌的生长产生抑制作用，所以菌落总数测试片中 TTC的浓度要以能灵敏显示细菌生长情况且对细菌无副作用为宜。当培养基中的TTC浓度为0.005% ～0.01%时，基本无抑菌现象。诱导剂的添加情况对菌落总数测试片的快速检测结果有重要影响。菌落总数测试片讲究快速，由于一部分细菌在24 h后才逐渐显现，所以在显色培养基中加入一些诱导物质以促进细菌快速生长显得尤为重要。常见的诱导剂有血消化液、胱氨酸、肝心浸液等。1999年有报道显示，在培养基中加入生长促进因子血消化液，可使这部分细菌在16 h后就能生长出来，而不加促进因子的培养基在 24 h后才开始生长。2004年有报道显示，胱氨酸等物质不仅具有增菌作用，还能增强显色剂的色度。营养物质方面除了要保证各类细菌生长所需的营养外，还应充分考虑显色培养基缓冲体系，可以添加氯化钠和磷酸二氢钾等缓冲剂，以保证细菌平衡，不受损伤。

3.2 菌落总数测试片产品

目前比较成熟的菌落总数测试片产品主要有美国3M公司的PetrifilmTM细菌总数测试片和德国拜发公司的 RIDA®COUNT微生物菌落计数板。广东环凯微生物科技有限公司也致力于菌落总数测试片的研究，并取得实质性进展。

3.2.1 美国3M公司的PetrifilmTM细菌总数测试片

美国3M公司发明的用于菌落计数的可再生水合物干膜（PetrifilmTMAerobie Count Plates）目前处于世界领先地位。它由上下两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格且覆盖有培养基，上层是聚丙烯薄膜。培养基中含有微生物生长及生化实验所需的营养及试剂，并通过一种冷水可溶性凝胶剂附着在上下两层膜上。常用的凝胶剂为果阿胶，另外还有黄原胶、洋豆胶等。生化试剂有特异性显色物质和抗生素。待测样品处理后不需要增菌，直接接种测试片，适宜温度培养后计数。测试片的外观呈长方形，未开封的铝箔袋冷藏于8℃的冰箱中，已开封的铝箔袋应用胶带将封口封紧，置于常温干燥处。

3M公司的PetrifilmTM测试片已通过国际组织AFNOR、FDA和AOAC的认可。使用方法：揭起覆盖的胶片，将 1 mL样品悬液滴于测试片中央后盖回，用压板轻轻压下，将样品均匀地覆盖于培养基上，静置约1 min，使培养基中的凝胶固化；将测试片水平放于37℃恒温箱内培养，细菌总数测试片培养48±3 h后所计的红色菌落数即为细菌总数。

近年来，美国3M公司对测试片做了很大的改进，在样品接种后48 h可准确报告结果。卢行安等对所选定的8类未加工和已加工食品进行菌落总数测定，利用3M公司的 PetrifilmTM菌落总数测试片测试，结果与采用 GB／T 4789.2—2010标准测定所得无统计学差异［5］。Heddeghen等用美国 3M公司测试片对鲜奶进行检测，其重复性较好。唐漪炎报道，采用3M公司的 PertifilmTM细菌总数测定纸片对消毒奶、酸奶、乳酸饮品、黄油、冰激凌、脱脂奶粉、奶酪、布丁、生奶等十余种产品进行检测，48±3 h报告结果，经统计对比，两种方法无显著差别，细菌总数测定纸片法检出率比国标法高。

虽然3M公司的PetrifilmTM测试片具有快速、方便、灵敏度高、特异性强等特点，但仍存在一些不足：价格昂贵，目前尚不适合在食品生产企业及基层单位全面推广；PetrifilmTM测试片上覆盖一层薄膜，当细菌产气、产黏液过多时会出现菌落的扩散，影响计数；计数方面，PetrifilmTM测试片面积较小，当菌量大于 250 cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能会使显色减缓，从而降低目测效果，导致计数偏低；培养基吸水较慢，如果在未均匀分布前用力挤压，会使稀释液体从边缘流出，影响结果；PetrifilmTM载体底板不透明，光源不能透射，不能用自动计数仪计数，需更多人力物力。

3.2.2 德国拜发公司的 RIDA®COUNT微生物菌落计数板

德国拜发公司的 RIDA®COUNT微生物菌落计数板选用的载体为硝酸纤维素型无纺布，它是一种将脱水培养基附着于无纺布棉垫上的即用型检测产品，由上下两部分组成，上层为透明覆盖膜，下层自上而下为无纺布层、底层涂有黏性物料的薄片和包含了培养基的水溶性复合膜。当样品液滴加在无纺布上时，会立刻扩散并溶解于复合膜内，形成高黏性的溶液，经培养后形成菌落。

德国拜发公司的 RIDA®COUNT微生物菌落计数板已经获得国际组织 AOAC的认可。使用方法：揭开覆盖膜，将1 mL样品悬液缓缓且均匀地滴于无纺布上，静置5 s，待样液完全吸收后，缓缓地将覆盖膜盖回，注意不要压盖无纺布部分，可沿薄膜边缘压紧；将接种后的测试片水平放于37℃恒温箱内培养，细菌总数测试片培养 48±2 h后所计红色菌落数即为细菌总数。这种微生物菌落计数板的不足是：不能两面数菌，易遗漏，影响计数；加样液后容易出现褶皱；不能挑菌作进一步实验。

4 结语

目前，食品安全问题已受到全社会的关注。食品安全检测产业迅猛发展，菌落总数的传统检测方法能较好地对菌落总数进行检测。在GB／T 4789.2—2008和 SN／T 1987—2007标准中，菌落总数测试片法是菌落总数测定的方法之一。可以预见，菌落总数测试片法将逐步成为传统检测手段的重要补充，甚至可能逐步成为主流的检测方法。菌落总数测试片具有良好的市场发展前景，但到目前为止，还未见过由我国自主研发的具有高灵敏度和高准确性的菌落总数测试片产品的相关报道，对菌落总数的检测仍主要采用传统的方法或购买较昂贵的国外产品，这对我国食品检测技术的发展造成了一定的阻障。因此，研发具有我国自主知识产权、具有高灵敏度和高特异性的菌落总数测定产品成为一项重要且紧迫的任务。

［1］吴毓薇，吴许文，吴清平，等.食品卫生微生物测试片检测技术进展［J］.中国卫生检验杂志，2008，（12）：2832－2834.

［2］李铁牛.纸片法检测饮料中菌落总数的研究［D］.重庆：西南农业大学，2004.

［3］孙永.食品卫生微生物快速测试卡的研制［D］.北京：中国科学院研究生院，2007.

［4］吕嘉枥，韩迪.MTT和 TTC在嗜酸乳杆菌菌落计数中的应用［J］.中国乳品工业，2007，（4）：23－25.

［5］卢行安，顾其芳，袁宝君，等.AOAC PetrifilmTM菌落总数测试片法与食品中菌落总数测定国标方法的比较研究［J］.中国食品学报，2011，（3）：164－167.

［责任编辑：罗 香］

Research Progress in Test Piece of Aerobic Bacterial Count

BAI Yang
（Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office，SIPO，Guangzhou 510530，Guangdong，China）

As a target for the extent of contamination in food，aerobic bacterial count is very important in sanitization，and it is a new kind of detection tool which is convenient to carry and free of media preparation.In recent years，experts and scholars have carried out some investigations on aerobic count.The comprehensive analysis for these studies has certain theoretical value and practical guiding significance.

aerobic bacterial count；test piece；research progress

TS201.6

：A

：1006－8481（2015）02－0001－04

2014－11－02

白阳（1987—），男，国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心，硕士。