五种中草药水溶性多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

陈丽华，曹可生，彭勤龙，潘自红，马庆一

（平顶山学院化学化工学院，河南 平顶山 467000）

五种中草药水溶性多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

陈丽华，曹可生，彭勤龙，潘自红，马庆一

（平顶山学院化学化工学院，河南 平顶山 467000）

从山茱萸、知母、甘草、地榆及诃子中提取水溶性多糖，并通过酶抑制动力学反应考察其对α-葡萄糖苷酶活性的影响。酶动力学反应结果表明：地榆多糖对α-葡萄糖苷酶有激活作用；知母多糖对α-葡萄糖苷酶的活性随时间的变化先激活后抑制；山茱萸多糖、甘草多糖及诃子多糖均对α-葡萄糖苷酶有抑制活性，其中抑制活性最好的是甘草多糖，其抑制率为72.5%；其各自的影响机理还有待进一步研究。

山茱萸；知母；甘草；地榆；诃子；α-葡萄糖苷酶；抑制率

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，已经成为继心血管和肿瘤之后的第三位“健康杀手”[1]。 研究还表明，餐后高血糖对心脑血管并发症的发生有着重要的影响[2]，α-葡萄糖苷酶又是血糖产生的关键酶，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性而降低餐后血糖是糖尿病防治的根本办法之一[3]，为此以降低α-葡萄糖苷酶活性为目的的糖尿病新药α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究逐渐兴起[4-11]。

从近些年来看，α-葡萄糖苷酶抑制剂大多从中草药植物中提取，提取的有效成分包括多糖，皂甙、黄酮、单宁、有机酸和生物碱等几大类[12]，其中尤以水溶性多糖提取f分离、纯化时试剂相对安全和其本身没有细胞毒性最为关注，据报道，已有近百种植物多糖被分离提取并进行了结构鉴定，用于探讨其降糖效果和机理研究[13，14]。

1 仪器试剂和材料

FFC-15粉碎机:山东即墨农业机械厂；QYQ微量移液器 ：北京表云航空仪表有限公司；ZFQ85A旋转蒸发器:上海医械专机厂；TGL-18C高速台式离心机: 上海安亭科学仪器厂； ZF-C三用紫外灯:上海康禾光电仪器有限公司；80-1离心沉淀器：上海手术器械厂；紫756MC外可见分光光度计 ：上海分析仪器厂；85-2磁力搅拌器江苏中大仪器厂；

对硝基苯酚（PNP）仪征市鼎信化工有限公司；α－葡萄糖苷酶 SIGMA；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) E.Merck公司；拜糖平：购于郑州药店；APD-600大孔树脂 西安树脂厂；山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子均购于郑州中药城；其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 中草药中多糖成分的提取[15]

取一定量的山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子粉碎过40目筛，备用。取5个洁净的500 mL的圆底烧瓶，称取山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子等五种中草药粗粉50 g分别加入其中,再分别加入95%乙醇（原料与醇的比为1∶10 w/v），加热回流2 h,热抽滤,取所得滤渣再用95%乙醇（原料与醇比为1∶8 w/v），再回流2 h, 后热抽滤，取滤渣加蒸馏水（原料与水比为1 ∶8 w/v）在55 ℃水浴下搅拌提取2 h,趁热抽滤，收集滤液，滤渣再加蒸馏水（原料与水比为1 ∶6 w/v）再回流提取2 h,趁热减压抽滤，收集并合并前次滤液，减压浓缩至原体积1/3，后加入适量的聚酰胺树脂过夜，后减压抽滤，收集滤液并真空浓缩后，定容，冷藏，待进行其组分的定性检测及酶抑制动力学测定。

2.2 多糖的定性检测[16,17]

α-萘酚试验（Molisch紫环反应）：取待检样品水溶液1 mL于试管中，先加入萘酚试剂（5%）3-5滴后充分振摇（注意不要溅出），再沿管壁滴入5-6滴浓硫酸，溶液出现分层，静置，待2～3 min后，观察两层液面间变化（出现紫红色环示有多糖或糖苷）。

三氯化铁试验：取待检样品的水溶液1 mL于试管中，加入FeCl3试剂2滴，观察颜色(呈现绿色、污绿色、蓝黑色或暗紫色示有鞣质类物质)。

明胶试验：取待检检样品的水溶液1 mL于试管中，加NaCl-明胶试剂2～3滴，观察结果（生成白色沉淀物示有鞣质类物质）。

盐酸-镁粉试验：取待检样品少许溶于乙醇中，取该溶液1mL于试管中，先放少量镁粉，然后滴加浓盐酸4～5滴，后置沸水浴中加热2～3 min，观察颜色（出现红色或粉红色有游离黄酮类或黄酮甙）。

泡沫试验：取待检样品的水溶液2 mL加入带塞试管中，用力持续振摇3 min，观察泡沫情况（产生持久性蜂窝状泡沫，泡沫可维持10 min以上且泡沫量应超过液体体积的1/3为皂苷）。

醋酐浓硫酸试验（Liebrmann Burchard反应）:取待检样品的水溶液少许，置蒸发皿中水浴蒸干，先加入少量冰醋酸于残渣中使其溶解，再加入醋酐-浓硫酸（19∶1）试剂，观察颜色变化（由黄色转变为红色、紫色、蓝色或绿色为皂苷类）。

氯仿-浓硫酸实验(Tschugaeff反应): 取待检检品的水溶液少许置蒸发皿中，于水浴上蒸干，先加入少量氯仿于残渣中,收集溶液于试管中，后再加入浓硫酸少许于试管,观察氯仿层颜色（呈现红或蓝色,硫酸层有绿色荧光出现）。

溴甲酚绿实验：在干燥的滤纸上滴1滴待检液体，待干燥后喷洒溴甲酚绿指示剂，观察颜色（有机酸即可在蓝色的背景上显黄色）。

2.3 多糖成分抑制效果的测定

2.3.1 α-葡萄糖苷酶活性的测定

方法1：取六支带塞试管，分别加入3 mL缓冲液（pH 6.81）和0.75 mL的PNPG溶液(2 mmol/L),于37℃水浴中保温10 min后，随后再分别加入15 µL的α -葡萄糖苷酶（酶的浓度为5.0 mg/mL）, 再于37℃水浴中反应，在2，4，6，8，10，15 min时各取一支加入适量4% Na2CO3用以终止上述反应，在波长400 nm处测定反应液的吸光值【18】。同时用未加酶的反应液为空白对照，以消除PNPG自身水解后产生的对硝基苯酚（PNP）对测定波长下吸光度的影响所造成偏差。

方法2：取一比皿，直接加入3 mL缓冲液（pH6.81）和0.75 mL的PNPG溶液(2 mmol/L)，放置10 min后再加入15 µL的α-葡萄糖苷酶（酶的浓度为5.0 mg/mL），每一分钟记录一次吸光度值。同时也用未加酶的反应液为空白对照。

2.3.2 各多糖的酶反应抑制活性的测定

反应体系见表1，操作同2.3.1中的方法2，以反应15 min时的吸光值为基准计算各组分的抑制率，实验以拜糖平标准品为对照。抑制率计算：

表1 各提取液抑制活性的反应体系Table 1 Reaction system for evaluating the effects of extracts on the activity of a-glucosidase

表2 定性检测结果Table 2 The results of qualitative test for inhibitors

3 结果与讨论

3.1 提取率

从山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子中提取、分离并部分纯化得到多糖得率分别为2.00%、1.27%、5.2%、3.0%、1.3%。

3.2 多糖成分的定性检测

山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子所提取多糖的定性检测结果如表2所示 。

3.3 实验条件的确定和α－葡萄糖苷酶活性的测定

由实验记录的37 ℃和室温26 ℃下所测时间所测得的的吸光度数值，绘制成A～t曲线，如图1所示。

图1 两种温度下A～t曲线图Fig.1 The absorb value curves of different temperature with time

由图1可知，在实验所取的这两个温度下吸光度仅有的差别是绝对数值的不同，但两曲线的变化趋势基本相像（即在同样的时间点上完成从直线到上翘弧线至平台的过渡），鉴于本实验考察的是多糖抑制率，与绝对值关系不大，为此实验拟将传统Tremblay[19]测定法改为在室温下比色皿中直接测定，方便实验进行。

3.4 多糖对α-葡萄糖苷酶活性的作用效果及其与拜堂平的比较

图2 多糖对酶作用的时间与吸光度曲线图（拜糖平为对照）Fig.2 The absorb value curves of all inhibitors extracted from Chinese herbals with time

山茱萸、地榆、知母、甘草、诃子中提取的活性多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果如图2所示，各组分对酶的抑制效果及与拜堂平的比较见图2。由图显示结果可知：山茱萸多糖、诃子多糖和甘草多糖均对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，其中，甘草多糖的抑制性最好；地榆多糖对α-葡萄糖苷酶活性有激活作用；知母多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响随时间的改变而不同，在0～11 min内是激活，11～15 min内是抑制，但抑制效果不显著。

以第15 min的吸光度计算有抑制活性多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率，可得诃子多糖抑制率为1.6%，山茱萸多糖抑制率为16.9%，抑制效果最好的是甘草多糖，抑制率为72.5%，且高于同浓度对照品拜糖平(糖平的抑制率为68.5%)。抑制率结果的直方图如图3所示。

图3 各成份的α-葡萄糖苷酶抑制率图Fig.3 The inhibit ratio of all inhibitors extracted from Chinese herbals

4 结论与展望

山茱萸、知母、甘草、地榆及诃子中提取水溶性多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响各不一样，知母多糖对α-葡萄糖苷酶的活性随时间的变化先激活后抑制，在0～11 min内对糖苷酶起激活作用，11～15 min内是抑制作用，但抑制效果不显著；山茱萸、甘草和诃子这三种中草药提取得到的水溶性多糖均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其中抑制活性最好的是甘草多糖，其抑制率为72.5%，诃子多糖抑制效果极差，仅为1.6%；其各自的影响机理及其它条件都还有待进一步研究。

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Influence on the Activity of α-glucosidase by Water-soluble Polysaccharide Form Five Kinds of Chinese Herbal

CENG Li-hua，CAO Ke-sheng，PEGN Qin-long，PAN Zi-hong，MA Qing-yi
（School of Chemistry and Chemical Engineering,Pingdingshan University, Pingdingshan Henan 476000，China )

The water-soluble polysaccharide was extracted from Cornus officinalis,Rhizoma anemarrhenaes, Licorice, Sanguisorba officinalis and Terminalia chebula ribs. Influence of these water-soluble polysaccharides on the activity of α-glucosidase was investigated by enzyme kinetics reaction. The results show that sanguisorba officinalis polysaccharide has the activation function to α-glucosidase;influence of Rhizoma anemarrhenae polysaccharide on α-glucosidase activity changes with time, activation first and then inhibition; Cornel polysaccharide, Licorice polysaccharide and Terminalia chebula ribs polysaccharide have inhibitory activities against α-glucosidase. Licorice polysaccharide shows the best α-glucosidase inhibitory activity of all, the inhibition rate can reach to 72.5 %.

Cornus officinalis; Rhizoma anemarrhenaes; Licorice; Sanguisorba officinalis ; Terminalia chebula ribs; α-glucosidase; Inhibition rate

TQ 028

： A

： 1671-0460（2015）01-0021-03

2014-07-07

陈丽华（1977-），女，河南信阳人，副教授，硕士研究生，2006年毕业于郑州轻工业学院食品与生物工程专业，研究方向：天然产物化学与食品功能因子。E-mail：249549769qq.com