猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型RT-LAMP检测方法建立

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（北京出入境检验检疫局，北京 100113）

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型RT-LAMP检测方法建立

蒲 静，汪 琳，尹 羿，柏亚铎，任 彤，张 伟，高志强，乌日古玛拉，时培蛟，肖春芳

（北京出入境检验检疫局，北京100113）

本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型ORF6基因的6个区域，利用2对引物建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP快速检测方法，该方法具有高灵敏度，高特异性的优点，在2小时左右即可得出结果，其灵敏度与PRRSV荧光RT-PCR检测方法相近，高于普通RT-PCR检测方法。将灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型培养物作10倍系列稀释，结果显示建立的荧光RT-PCR的检测极限可达10-7，RT-PCR检测方法的检测极限为10-5，RT-LAMP检测方法达到10-8，表明建立的RT-LAMP检测方法非常灵敏，可用于检测猪组织样本中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；美洲型；RT-LAMP

猪繁殖和呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）以妊娠母猪流产，早产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和肥育猪的呼吸道症状为特征[1，2]。猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种单股正链的RNA病毒，可分为两个基因型，即欧洲型和美洲型[3]。PRRSV 基因组长约15kb，具有9个开放阅读框架（ORFs）。常用的分子生物学方法为普通RT-PCR和荧光RTPCR，荧光RT-PCR是国际上公认快速准确的技术之一，但存在设备相对昂贵的缺点[4-7]。 等温扩增技术RT-LAMP不需要模板的热变性，扩增效率高，具有不需要特殊仪器、快速、特异性强的特点，而且结果判定简单。本研究针对美洲型PRRS病毒建立了RT-LAMP检测技术[8-9]。并通过特异性和灵敏度评价，进而用于临床样本检测，为现场检测美洲型PRRS病毒提供一种快速可靠的方法[10]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

TRIZOL，购自Invitrogen公司；AMV 反转录酶，dNTP购自Promega 公司；Bst DNA 聚合酶购自NEB 公司；betaine购自Sigma 公司；SYBR Green I 购自Invitrogen 公司；HNB（hydroxynaphthol blue），分子式C20H11N2Na3O11S3，M＝620.47g/ Mol，购自Fluka公司；Taq DNA聚合酶和PCR相关试剂，购自Promega公司；PRRS病毒美洲型荧光RT-PCR检测试剂盒，本实验室研制；RNA酶抑制剂，购自Promega公司；无水乙醇，分析纯，-20 ℃ 预冷；75%乙醇，用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC 水（符合GB 6682－92 要求）配制，-20 ℃预冷。

台式冷冻高速离心机（离心速度可达12 000 r/ min）；台式电子天平；常规PCR仪；荧光PCR检测仪（ABI 7900HT，Roche 1.1）；离心机（离心速度3 000 r/min）。

1.2 灭活病毒及核酸

检测方法研究中用病毒株及其来源如表1所列。

表1 各种病毒种类

1.3 病毒RNA提取

向加有600μL裂解液的灭菌离心管中加入待测样本200μL，用吸头反复抽吸混匀；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s或颠倒混匀15次（不宜过于强烈，以免产生乳化层）；12000g离心 15min；另取灭菌离心管，加入600μL异丙醇（－20℃预冷），并加入上述离心后的上层液相（注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质），颠倒混匀；12000g离心15min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体；加入600μL 75%乙醇（-20℃预冷），颠倒洗涤；12000g离心10min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量吸干液体；离心5s，将管底部少量液体用微量加样器吸干。室温干燥5min；干燥后于沉淀中加11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA（即为所需RNA）。

1.4 引物设计

为确保探针的保守性和特异性，我们针对目前已知的3个不同亚群的猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸[11]，选取ORF6基因编码区特定序列作为靶区域，应用DNAMAN在多重序列比对的基础上，设计引物（图1，表2）。引物FIP和BIP针对的2个扩增区域之间用TTTT进行连接，以便于扩增时成环。

1.5 引物筛选

将上述引物对进行试验。根据采用的反应体系（表3），猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型07-14提取RNA后，将RNA以1：104稀释后，进行RT-LAMP检测，反应参数为60℃/60min，80℃/15min。

1.6 RT-LAMP反应体系的建立与优化

1.6.1 反应物浓度优化

MgSO4、betaine、dNTP的浓度以及反应时间和温度对LAMP反应效率有一定影响，通过逐一优化，确定反应体系和条件。

1.6.2 反应温度和时间的优化

对反应温度和时间都进行了优化试验，以期达到最佳扩增效率，主要比较了以下几种循环条件的扩增效率。

方法A - 60℃：60min，80℃ 15min；

方法B - 60℃：90min，80℃ 15min；

方法C - 60℃：120min，80℃ 15min；

方法D - 62℃：120min，80℃ 15min；

方法E - 50℃：15min，60℃：120min，80℃ 15min。

1.7 灵敏度试验

将猪繁殖与呼吸综合征病毒07-14核酸作10-1～10-8稀释，分别用RT-LAMP，普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测，比较方法的灵敏度。

图1 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型3个不同亚群的的序列比对和引物设计

表2 研究过程中涉及引物名称、序列

表3 RT-LAMP反应体系

1.8 特异性试验

用所建立的方法对欧洲型PRRS病毒LV核酸、猪伪狂犬病病毒核酸、猪瘟病毒C株核酸和猪链球菌2型ZY株核酸，分别进行检测，验证方法的特异性。

1.9 重复性试验

连续3次分别用建立的RT-LAMP检 测 方 法 10-5、10-6、10-7稀 释 病 毒07-14核酸的进行重复性试验，验证方法的可重复性和稳定性。

1.10 快速显色研究

在建立RT-LAMP检测方法基础上，分别将SYBR Green I 和HNB两种染色液加入反应体系，比较显色情况。SYBR Green I购买后直接使用；HNB为粉末，称量0.946g，用DEPC水定容于50mL离心管中。取6管1.5mL离心管，每管加入900μL DEPC水，再分别加入100μL 30mmol/L HNB；配成3mmol/L HNB溶液。

1.11 临床样品检测

2006—2007年某地区数个规模化猪场采集的病料（各种内脏和肌肉组织）49份应用建立的RT-LAMP方法进行检测，并与荧光RT-PCR和常规RT-PCR检测方法进行比较。

2 结果

2.1 引物筛选结果

采用上述条件，筛选出能检出所用3株美洲型病毒核酸，且扩增稳定的引物对：PRRS2-F3，PRRS2-B3，PRRS2-FIP，PRRS2-BIP。

2.2 反应体系优化结果

按照GB/T19438.1所叙方法提取病毒RNA。由于MgSO4，betaine，dNTP的浓度以及反应时间和温度对LAMP反应效率有一定影响，通过逐一优化，确定了如下反应体系和条件（表4）。

图2 引物筛选试验结果

表4 建立的RT-LAMP反应体系

2.3 反应温度和时间优化

采用5种条件对相同的反应体系进行扩增，效率相近，因此选择效果最好的等温方法，即以方法C作为等温扩增时的反应条件。

2.4 灵敏度试验

将病毒07-14核酸作10-1～10-8稀释，应用建立的RT-LAMP检测，显示该方法的灵敏度达到10-8（图3）。用建立的方法与荧光定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法进行比较，表明建立的方法灵敏度与荧光定量RT-PCR方法相近，但明显高于常规RT-PCR检测方法（图6）。

图3 RT-LAMP对病毒07-14核酸检测灵敏度

图4 反应结束后，阳性扩增可见明显的混浊（左侧2管），阴性反应清亮（右侧1管）

图5 反应结束后，加入SYBR Green I进行染色的结果

图6 RT-LAMP与荧光定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的比较

图7 建立的RT-LAMP的特异性试验结果

图8 HNB染色结果

2.5特异性试验

用所建立的方法对欧洲型PRRS病毒LV核酸、猪伪狂犬病病毒核酸、猪瘟病毒C株核酸和猪链球菌2型ZY株核酸分别进行检测，验证方法的特异性。结果显示本法特异性良好，无交叉反应（图7）。

2.6 重复性试验结果

连续3次分别用建立的RT-LAMP检测方法10-5，10-6，10-7稀释病毒07-14核酸的进行重复性试验，以验证方法的可重复性和稳定性。结果显示3个稀释度的病毒核酸均为阳性，重复性好。

2.7 快速显色研究

在建立RT-LAMP检测方法基础上，分别将SYBR Green I 和HNB两种染色液加入反应体系，比较显色情况。结果显示SYBR Green I在反应前加入反应体系影响扩增结果，且显色明显程度不如HNB。而HNB在反应前加入反应体系不影响扩增效果（图8）。

2.8 临床样品检测结果

2006—2007年某地区数个规模化猪场采集的病料（各种内脏和肌肉组织）49份应用建立的RT-LAMP方法进行检测，并与荧光RTPCR和常规RT-PCR检测方法进行比较。结果显示RT-LAMP与荧光RTPCR结果完全一致，符合率100%，检出率高于普通RT-PCR检测结果（表5）

表5 49份临床样品的检测结果

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征于1987年首先出现于美国[12]，20多年来特别是2006年发生于我国的高致病性PRRS，给养猪业造成巨大经济损失而引起了科学界的关注[13-15]。

PRRS 的诊断方法有多种[16]，往往依据临床症状和病理变化只可做出初步诊断，所以还应该根据实验室诊断技术加以确诊。对于病原检测，目前常用方法为病毒分离鉴定、抗原捕获检测和分子生物学检测方法[17-20]。有报道用定量TaqMan RT-PCR 方法检测PRRSV，通过与其它方法比较发现，在省时、易用性、敏感性及特异性上都有很不错的表现，而且不仅能够减少交叉污染的风险，还能区分不同的毒株[21-23]。我们通过运用建立的方法对猪瘟病毒核酸、伪狂犬病毒核酸以及猪链球菌2型核酸进行检测，无交叉反应，表明特异性良好。试验中还发现LAMP由于产物量大，开盖检测很容易发生气溶胶污染，因此需要更为严格的实验室管理措施，尽量做到不开盖检测。

本研究中，应用建立的方法对49份临床样本进行了检测，结果显示建立的RT-LAMP检测方法与荧光RT-PCR试验结果完全一致。

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Development of an RT-LAMP Assay for Detection of American Type Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus（PRRSV）

Pu Jing，Wang Ling，Ying Yi，Bo Yaduo，Zhang Wei，Gao Zhiqiang，Wurigumala，Shi Peijiao，Xiao Chunfang（Beijing Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100113）

Two pairs of primers targeting six regions of American-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF6 gene，and RT-LAMP assay was established for the rapid detection of porcine reproductive and respiratory virus with high sensitivity and specifi city. It could be fi nished in about 2 hours. The sensitivity of the assay was similar to PRRSV fluorescent RT-PCR，and higher than the normal RT-PCR. The inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus culture was serially diluted in 10-folds，and tested with PRRSV fl uorescent RT-PCR，RTLAMP assay and normal RT-PCR. The result showed that the fl uorescence RT-PCR detection limit was up to 10-7，the normal RT-PCR detection limit was 10-5，and the RT-LAMP detection limit was 10-8，indicating RT-LAMP assay was very sensitive. The assay could be used for rapid detection of the American-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus in various pig tissue samples.

porcine reproductive and respiratory syndrome；American- type virus；RT-LAMP

S852．651

：A

：1005-944X（2015）02-0057-06

国家质检总局科技计划项目（2013IK027）资助

：蒲静